Name: Bromodeossiuridina (BrdU) Etichettatura e successive ordinamento fluorescenza cellulare attivo per la cultura indipendente Identificazione di carbonio organico disciolto-degradanti batterioplancton (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Scopri l'etichettatura con BrdU e il FACS per identificare batterioplancton che degradano carbonio organico disciolto in campioni d'acqua. Questo metodo consente l'isolamento di cellule attive per studi di ecologia microbica.

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Il finanziamento di questo progetto è stato fornito dal National Science Foundation concede OCE1029607 (a XM) e MCB0702125 (a MAM) e Gordon and Betty Moore Foundation (a MAM).

1. Acqua esempio per l'elaborazione <ol><li> Filtrare l'acqua 10L ambientale attraverso 1 micron-pori di dimensioni filtri a membrana per rimuovere le particelle più grandi e bacteriovores. Raccogliere il filtrato l'acqua in una damigiana. </li><li> Trasferire 36 ml ciascuno filtrato in 3 provette sterili Eppendorf (50 ml) contenente 4 ml di soluzione appena preparata paraformaldeide (PFA; 10%). Incubare per 2 ore a temperatura ambiente per preservare le cellule. Raccogliere le cellule su 0,22-micron-pori di dimensioni filtri a membrana bianca per filtrazione a vuoto. Lavare il filtro facendo passare 10 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS) attraverso il filtro per filtrazione a vuoto. Etichetta i filtri come controlli negativi e conservarli a -20 ° C. </li></ol> Passi 1,3-1,4 sono opzionali per stabilire DOC-limitata condizioni. <ol start="3"><li> Aggiungere una miscela di azoto inorganico e fosforo (5 mM NH 4 Cl, 5 mM NaNO 3 e 1μM NaH 2 PO 4 concentrazione finale) nella damigiana. </li><li> Incubare al buio a temperatura in situ per 48 ore con agitazioni occasionali. </li></ol> 2. Microcosmo creazione e l'incubazione <ol><li> Riempire ogni sei 1-L vasi in vetro con 800 ml di acqua campione dalla damigiana di passo da 1,4 a stabilire microcosmi. Aggiungi BrdU (10 micron, concentrazione finale) per ogni microcosmo. Mescolare bene. </li><li> Aggiungere 1 ml di modello DOC soluzione composta in tre dei microcosmi, queste modifiche serviranno come DOC. Aggiungere 1 ml di PBS sterile nei tre microcosmi restanti, queste serviranno come no-Oltre controlli. </li><li> Incubare tutte le microcosmi in un agitatore incubatore e incubare al buio a temperatura in situ agitando a 100 giri al minuto. </li><li> Raccogliere 36 ml di campione d'acqua da ogni microcosmo e trasferire 50 ml in provette sterili Eppendorf in momenti di 0, 8, 16 e 24 ore. Immediatamente aggiungere 4 ml di fresca PFA (10%) ai tubi di raccolta e incubare per 2 ore a temperatura ambiente per preservare le cellule. </li><li> Filtro conservate cellule attraverso 0.22-micron-pori di dimensioni filtri a membrana in policarbonato. Lavare i filtri con 10 ml di PBS. Procedere immediatamente alla fase successiva o conservare i filtri a -20 ° C. </li></ol> 3. Immunolocalizzazione in situ per incorporazione di BrdU <ol><li> Scongelare i filtri (campioni DOC modificato, senza aggiunta controlli e controlli negativi) a temperatura ambiente. </li><li> Applicare 1 ml di soluzione di lisozima [10 mg / ml di lisozima albume in 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] 4 per coprire le cellule batteriche sul filtro. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare il filtro facendo passare 10 ml di PBS attraverso di essa sotto aspirazione. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione di proteinasi K [2 mg / ml di proteinasi K in 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] 4 per coprire le cellule batteriche sul filtro. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare il filtro facendo passare 10 ml di PBS attraverso di essa sotto aspirazione. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione esonucleasi [esonucleasi III (50 U / ml) in 5 mM MgCl 2 e 50 mM Tris-HCl] 5 per coprire le cellule batteriche sul filtro. Incubare a 37 ° C per 30 minuti. Lavare il filtro facendo passare 10 ml di PBS attraverso di essa sotto aspirazione. </li><li> Montare frame-sigillo camere di incubazione (Bio-Rad) secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Tagliate il filtro in ottavi con una lama sterile su un alcool-superficie asciutta e pulita. </li><li> Utilizzando pinze, posto una sezione ottavo di filtro montato in un quadro di tenuta della camera di incubazione (otto frame-sigillo camere sono necessari per ogni campione filtro). Il lato della sezione di filtro che contiene cellule deve essere rivolto verso l'alto. L'umidità nella parte posteriore del filtro permetterà il bastone filtro alla diapositiva. Se il filtro si secchi, applicare una piccola goccia (2 mL) di DIH 2 O nel centro della camera prima di mettere la sezione filtro sul vetrino. </li></ol> Passi 3,8-3,20 utilizzare i reagenti dalla ROCHE In Situ Kit proliferazione cellulare, FLUOS seguenti procedure modificate dalle istruzioni del produttore. Fatta eccezione per la PBS, tutti i reagenti sono forniti nel kit. <ol start="8"><li> Applicare tampone abbastanza incubazione (0,5% di siero bovino albume, 0,1% Tween20 in PBS,) per coprire in modo uniforme l'intera sezione del filtro nella camera di incubazione senza causare overflow di una volta la guarnizione viene applicata. </li><li> Inserire una struttura di copertura in poliestere sopra la struttura della camera di incubazione. Premere verso il basso per sigillare ermeticamente la camera di incubazione. Evitare bolle d'aria al di sopra del filtro. Incubare le camere sigillate per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. </li><li> Rimuovere il sigillo di poliestere e aprire le camere di incubazione. (Nota: l'apertura delle camere a volte tirerà su il sigillo telaio dalla diapositiva In questo caso, preparare una nuova camera per i seguenti passaggi..) </li><li> Pipettare il buffer di incubazione da un angolo della camera. Evitare il contatto con il filtro. </li><li> Lavare il filtro pipettando gentilmente 100 l di PBS efuori dalla camera di 3 volte. </li><li> Preparare anti-BrdU-FLUOS soluzione di lavoro seguendo la procedura raccomandata dal produttore immediatamente prima dell'uso. </li><li> Pipettare 120 microlitri anti-BrdU-FLUOS soluzione di lavoro sul filtro, avendo cura di coprire uniformemente tutta la superficie. </li><li> Richiudere la camera con una copertura in poliestere nuovo. Evitare bolle d'aria sulla parte superiore del filtro. Incubare la camera al buio a 37 ° C per 3 ore. Questo passo etichetta BrdU DNA incorporato in situ con isotiocianato di fluorescina (FITC). </li><li> Rimuovere la copertura in poliestere e aprire la camera di incubazione. Pipettare il anti-BrdU-FLUOS soluzione di lavoro. Lavare il filtro 3 volte con PBS. </li><li> Trasferire il filtro dalla camera di incubazione per una superficie sterile. Tagliate la sezione filtro in piccoli pezzi con una lama sterile. </li><li> Trasferire il filtro in 2 pezzi microprovette ml, contenenti ciascuno 1 ml di PBS. Strettamente tappo del tubo e sigillare con parafilm. Incubare a 37 ° C e 200 rpm per 10 min. </li><li> Fissare i tubi in un vortice vortex e alla velocità massima per 5 minuti. Pipetta il sopranatante in una provetta sterile 15 ml Eppendorf. Ripetere le fasi di incubazione e vortex per 5 volte di più. Combina il surnatante nello stesso tubo 15 ml Eppendorf per ogni campione. Tipicamente, l'80% di cellule possono essere recuperati in sospensione. </li><li> Conservare il supernatante con le cellule risospese a 4 ° C. Ordina entro 2 giorni. </li></ol> 4. FACS analisi Una procedura per un citometro di flusso BD FACSAria e relativo software è descritto qui. <ol><li> Ottimizzare l'impostazione delle fasi del citometro a flusso seguito consigliato dal produttore. Ciò comporta: regolando il controllo di amplificazione per impostare i parametri richiesti e breakoff lo sweet spot, ottimizzando il ritardo laser e fattori di scala area per la pressione guaina esperimento e ottimizzare le impostazioni per FSC e tensioni SSC, soglia FSC, FSC scala fluorescenza, fluorescenza tensioni PMT , ecc </li><li> Esegui campioni di controllo negativo sul citometro a flusso (FCM) sulla base di intensità di fluorescenza di dispersione FITC e laterali (SSC). Aumentare la soglia fino a quando non FITC cellule nei controlli negativi possono essere visualizzati dal FITC-SSC visualizzazione acquisizione. </li><li> Eseguire senza aggiunta campioni di controllo e esaminare il modello di distribuzione di 10.000 celle in base a FITC e acquisizione SSC. Definire un cancello di racchiudere tutte le cellule e designare come "celle a bassa intensità" (LIS). </li><li> Esegui DOC-modificato campioni ed esaminare il modello di distribuzione di 10.000 celle in base a FITC e SSC. Alcune cellule apparirà nel cancello preset LI. Definire un altro cancello per racchiudere le cellule che hanno una maggiore intensità di fluorescenza (HIS) di LIS. Acquisire le statistiche per vedere la relativa abbondanza di cellule gated. </li><li> Celle di tipo HI in provette contenenti 500 microlitri PBS a "purificare 1 goccia" modalità. Termina ordinamento quando il numero dei suoi raggiunge 500.000 conta. </li></ol> 5. Filtro amplificazione di geni rRNA 16S Filtro procedure di PCR vengono modificati da Kirchman et al 6. <ol><li> Filtro cellule ordinati su un bianco, 0,22 micron-pori di dimensioni, 25 mm di diametro, in policarbonato membrana del filtro. Tagliare il bordo del filtro che contiene le cellule batteriche con una lama sterile. Tagliate il filtro in 8 pezzi uguali dimensioni. </li><li> Posizionare un pezzo unico filtro in un tubo di reazione di PCR, con le cellule rivolti verso l'interno del tubo. Aggiungere 45 microlitri di acqua grado di PCR nel tubo di reazione PCR. Immergere il filtro completamente in acqua. </li><li> Aggiungere 2 ROCHE illustrazioni PuReTaq Read-To-Go PCR Beads nel tubo di reazione PCR, mescolare brevemente nel vortex. Aggiungere 2 microlitri ciascuno degli avanti e indietro primer gene rRNA 16S (0,4 microM concentrazione finale per ciascun primer), come 27F e 1492R 7, in ciascuna delle provette di reazione della PCR. </li><li> (Facoltativo) Aggiungere 1ml soluzione di albumina sierica bovina (BSA, concentrazione finale è 30μg/100 microlitri) alla miscela di reazione PCR per aiutare inibitori dell'amplificazione assorbire. Se uno sceglie di non aggiungere BSA, aggiungere 1ml di acqua, invece. </li><li> Eseguire la PCR su un termociclatore. Un tocco giù programma PCR si raccomanda, che è la temperatura di ricottura sequenzialmente decrescenti 62-52 ° C di 1 ° C per ciclo per 11 cicli, seguiti da 15 cicli con temperatura di annealing di 52 ° C. Tutti i cicli sono denaturazione (a 95 ° C), ricottura (a 62 a 52 ° C), ed estensione (a 72 ° C) le misure di durata 50 anni. Un primo 3-min di denaturazione e una finale di 10 minuti passo estensione è inoltre inclusa nel programma PCR. </li><li> Conferma PCR mediante elettroforesi su un bromuro macchiato etidio 1% gel. Dell'accisa gli ampliconi della PCR dal gel e pulire con l'estrazione QIAGEN QIAquick kit gel. </li><li> Eseguire due ulteriori amplificazioni PCR per ogni campione, ogni volta che utilizzano una nuova sezione filtro. Dopo la PCR gel purificatiin poi, la piscina ampliconi del campione stesso insieme. Purificata 16S rDNA ampliconi sono ora pronti per una serie di analisi molecolari che permettono l'identificazione tassonomica, come la costruzione clone biblioteca e sequenziamento. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: I risultati rappresentativi sono descritte utilizzando uno studio di putrescina-degradante batteri come esempio. Campioni di acqua sono stati raccolti in un sito costiero della Georgia e trattati seguendo le procedure sopra descritte. FACS analisi ha rivelato che oltre putrescina indotto lo sviluppo di un gruppo di batteri ad alta intensità FITC fluorescenza, indicando alto tasso di incorporazione di BrdU (Figura 1). Queste cellule sono state designate come high-BrdU-incorporazione cellule (HIS) e ci si aspettava che contengono principalmente putrescina-degradanti batteri. Il suo mancavano nel no-aggiunta controlli, che conteneva solo le cellule con livelli inferiori di incorporazione di BrdU (LIS). LI ci si aspettava che contengono principalmente batterioplancton che sono stati in grado di utilizzare putrescina aggiunto. I suoi sono stati ordinati in tubi separati e poi raccolto su filtri a membrana. Ampliconi gene 16S rRNA sono stati ottenuti per le celle ad alta HI con filtro PCR. <img src="/files/ftp_upload/2855/2855fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Analisi citofluorimetrica la mancata aggiunta di controllo e il modello-compound-modificato (putrescina ad esempio qui) i campioni raccolti dopo 24 ore di incubazione. Analisi della distribuzione delle cellule si è basata su (1) intensità di fluorescenza del FITC etichettatura (asse x), che è positivamente correlata al livello di incorporazione di BrdU, e (2) side scatter (SSC, asse y), che è positivamente correlato alla cella dimensioni. Notazione cancello si basa sul livello di incorporazione di BrdU, (HI, high-BrdU-incorporazione, LI, basso BrdU-incorporazione). La percentuale relativa di HI e cellule LI sono riportati nella cancelli corrispondente.

<ol><li>Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DNA-synthesizing+bacterial+cells+in+coastal+North+Sea+plankton%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).</li>
<li>Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochemical+detection+and+isolation+of+DNA+from+metabolically+active+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).</li>
<li>Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterioplankton+assemblages+transforming+dissolved+organic+compounds+in+coastal+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater.</a> Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).</li>
<li>Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+PCR+for+visualization+of+microscale+distribution+of+specific+genes+and+gene+products+in+prokaryotic+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).</li>
<li>Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodeoxyuridine+%28BrdU%29+immunocytochemistry+by+exonuclease+III+%28Exo+III%29+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion.</a> Histochemistry. 98, 199-199 (1992).</li>
<li>Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacterial+communities+in+aquatic+systems+as+revealed+by+filter+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+Microb.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR.</a> Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).</li>
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<li>Mou, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+carbon+processing+by+generalist+species+in+the+coastal+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean.</a> Nature. 451, 708-708 (2008).</li>
<li>Mou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+cell+sorting+and+subsequent+molecular+analyses+for+culture-independent+identification+of+bacterioplankton+involved+in+dimethylsulfoniopropionate+transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).</li>
<li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il nostro approccio coppie BrdU incorporazione, FACS analisi e 16S rDNA per consentire l&#39;identificazione delle specie a livello di batterioplancton che metabolizzano i singoli componenti DOC in ambienti acquatici. Il saggio di incorporazione di BrdU etichette cellule batteriche sulla base di attività metabolica, che permette l&#39;analisi solo sui batteri attivi e quindi non include le cellule dormienti. Nel nostro approccio, incorporazione di BrdU è nei batteri in situ immunodetected e che hanno d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> BrdU </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> B5002-5G </td><td></td></tr><tr><td> Lisozima </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> L6876-5G </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasi K </td><td> Reagente </td><td> Sigma </td><td> P2308-25mg </td><td></td></tr><tr><td> In Situ Kit proliferazione delle cellule, FLUOS </td><td> Kit </td><td> Roche </td><td> 11810740001 </td><td> Consumano più di Anti-BrdU-FLUOS e buffer di incubazione per reazione rispetto a quanto suggerito dal produttore. </td></tr><tr><td> Frame-Seal incubazione Chambers </td><td> Materiale </td><td> Bio-Rad </td><td> SLF-1201 </td><td></td></tr><tr><td> I filtri a membrana in policarbonato (142 mm di diametro, 1,0 micron-poro-size) </td><td> Materiale </td><td> Millipore </td><td> FALP14250 </td><td></td></tr><tr><td> I filtri a membrana in policarbonato (25-mm di diametro, 0,2 micron a poro-size) </td><td> Materiale </td><td> Millipore </td><td> FGLP02500 </td><td></td></tr><tr><td> illustrazioni PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads </td><td> Kit </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-9559-01 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick gel kit di estrazione </td><td> Kit </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> FailSafe PCR System </td><td> Kit </td><td> Epicentre </td><td> FS99060 </td><td></td></tr></tbody></table>

bromodeossiuridina (brdu) etichettatura e successive ordinamento fluorescenza cellulare attivo per la cultura indipendente identificazione di carbonio organico disciolto-degradanti batterioplancton

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

I microbi sono agenti principali mediare la degradazione di numerosi carbonio organico disciolto (DOC) substrati in ambienti acquatici. Tuttavia, l&#39;identificazione di taxa batterici che trasformano piscine specifiche di DOC in natura rappresenta una sfida tecnica. Qui si descrive un approccio che le coppie bromodeossiuridina (BrdU) l&#39;incorporazione, fluorescenza cell sorting attivato (FACS) e 16S rRNA gene-based analisi molecolare che consente di cultura indipendente identificazione di batterioplancton in grado di degradare un composto DOC specifico in ambienti acquatici. Microcosmi batterioplancton tre esemplari sono impostati per ricevere sia BrdU e un composto modello DOC (DOC emendamenti), oppure solo BrdU (senza aggiunta di controllo). Sostituti BrdU le posizioni di timidina nel DNA di nuova sintesi batterica e BrdU marcato DNA può essere facilmente immunodetected 1,2. Attraverso una 24-ore di incubazione, batterioplancton che sono in grado di utilizzare il composto aggiunto DOC dovrebbero essere selettivamente attivato, e quindi hanno più alti livelli di incorporazione di BrdU (cellule HI) che non rispondono le cellule negli emendamenti DOC e le cellule nel no- Inoltre controlla (basso cellule incorporazione di BrdU, le cellule LI). Dopo immunolocalizzazione fluorescenza, le cellule si distinguono HI e fisicamente separato dalle cellule LI da fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) 3. Ordinati DOC-responsive cellule (cellule HI) vengono estratte per il DNA e tassonomicamente individuate attraverso successive rRNA 16S a base genetica tra cui analisi di PCR, la costruzione della libreria clone e sequenziamento.

Batterioplancton ambientali vengono incubate con un modello di carbonio organico disciolto (DOC) e un reattivo composto di etichettatura del DNA, bromodeossiuridina (BrdU). In seguito, DOC-degradante celle sono separate dalla comunità di massa in base alla loro elevata incorporazione di BrdU usando fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS). Queste cellule vengono poi identificati da successive analisi molecolari.

Bromodeossiuridina (BrdU) Etichettatura e successive ordinamento fluorescenza cellulare attivo per la cultura indipendente Identificazione di carbonio organico disciolto-degradanti batterioplancton

I microbi sono i principali agenti che mediano la degradazione di numerosi substrati di carbonio organico disciolto (DOC) negli ambienti acquatici. Tuttavia, l'identificazione ...

I microrganismi intervengono nella degradazione di numerose sostanze organiche disciolte o composti DOC, come nei sistemi fluviali e negli ambienti acquatici. Per comprendere appieno il ruolo dei microrganismi nella trasformazione del DOC, è necessario identificare simultaneamente la loro tassonomia e funzione. Questo video illustra una procedura per l'identificazione tassonomica di batteri liberi o plancton batterico che trasformano specifiche frazioni di DOC negli ambienti acquatici.Dei campioni d'acqua raccolti da un ambiente di prova vengono processati e incubati con un composto di interesse e bromodesossiuridina, BRDU, che si incorpora nel DNA appena sintetizzato e nelle cellule attivamente in crescita. Successivamente, il plancton batterico marcato con BRDU viene etichettato con anticorpi anti-BRDU coniugati con ZI. Il plancton batterico con elevati livelli di marcatura BRDU viene isolato mediante sorting cellulare attivato da fluorescenza.Il DNA viene quindi estratto dalle cellule ordinate e l'identificazione tassonomica viene effettuata in base ai risultati dell'analisi del gene dell'RNA ribosomiale 16S mediante PCR. Ciao, mi chiamo Steven Robbins del laboratorio della dottoressa Chen Mao del Dipartimento di Scienze Biologiche della Kent State University. Oggi s lu e io vi mostreremo un metodo indipendente dalla coltura per l'identificazione del plancton batterico degradatore di DOC negli ambienti acquatici.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'aggiunta di nutrienti seguita dall'analisi del DNA della comunità batterica, consiste nel concentrare l'analisi sui batteri altamente attivi, escludendo le cellule inattive e quelle con crescita lenta. In questo studio mostriamo l'identificazione di batteri associati alla pianta di plantain che utilizzano un particolare composto DOC. Tuttavia, questo metodo può essere applicato anche per studiare il plancton batterico che utilizza altri singoli composti DOC o gruppi di composti DOC, come gli esudati algali.Preleviamo quindi alcuni campioni d'acqua e iniziamo. Prima di analizzare i campioni d'acqua per individuare il plancton batterico degradatore di DOC, i campioni devono essere opportunamente trattati. I campioni mostrati qui sono stati raccolti dalla costa della Georgia per rimuovere le particelle grandi e i VRE ER dal campione d'acqua.Utilizzare una pompa peristaltica per trasferire l'acqua dal carboy di raccolta a un'unità di filtrazione dotata di un filtro con pori di dimensione pari a un micrometro. Successivamente, trasferire aliquote da 36 millilitri del filtrato in tre provette sterili in polipropilene da 50 millilitri, ciascuna contenente quattro millilitri di soluzione al 10% di paraformaldeide appena preparata. Incubare per due ore a temperatura ambiente per preservare le cellule, successivamente all'incubazione.Versare l'acqua nella torre di filtrazione di un'unità di filtrazione a vuoto in vetro dotata di filtri a membrana bianchi con pori di dimensione pari a 0,22 micrometri ed applicare il vuoto per far passare la soluzione. Lavare il filtro applicando 10 millilitri di PBS attraverso il filtro a vuoto. Etichettare i filtri come controlli negativi e conservarli a meno 20 gradi Celsius.Per creare un ecosistema sperimentale o un microcosmo, iniziare riempiendo sei fiale di vetro da un litro, preventivamente risciacquate, con 800 millilitri del campione d'acqua prefiltrato. Aggiungere BRDU a ciascun microcosmo fino a una concentrazione finale di 10 micromolare. Ruotare rapidamente la fiala a mano per mescolare.Ogni campione verrà sottoposto a saggio in triplicato. Pertanto, aggiungere il composto modello di DOC a tre dei microcosmi. Qui, la reina viene aggiunta ai microcosmi a una concentrazione finale di 100 nanomolar.Quindi aggiungere ai rimanenti tre microcosmi PBS sterile. Questi serviranno come controlli senza DOC; posizionare tutti i microcosmi in un incubatore sotto agitazione a 100 giri al minuto, al buio e alla temperatura in situ, pari a 25 gradi Celsius. In questi momenti, prelevare campioni ai tempi 0, 8, 16 e 24 ore.Prelevare 36 millilitri da ciascun microcosmo in un tubo sterile di polipropilene da 50 millilitri contenente quattro millilitri di paraformaldeide fresca al 10%, incubare per due ore a temperatura ambiente per fissare le cellule. Successivamente, filtrare le cellule fissate attraverso filtri in membrana bianca con porosità di 0,22 micrometri. Applicare 10 millilitri di PBS attraverso il filtro sotto vuoto per rimuovere i residui di PFA.Procedere immediatamente alla rilevazione immunocitochimica INS situ oppure conservare i filtri a meno 20 gradi Celsius per il saggio di incorporazione di BRDU nel plancton batterico. Iniziare lasciando i filtri del campione a temperatura ambiente per alterare la parete cellulare batterica. Posizionare il filtro su un'unità di filtrazione, quindi pipettare un millilitro di soluzione di lisozima sul filtro in modo da coprire le cellule e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.Dopo l'incubazione, applicare un vuoto per rimuovere la soluzione. Una volta che la soluzione è passata attraverso il filtro, lavare le cellule aggiungendo 10 millilitri di PBS ed applicare un vuoto. Poi, per compromettere ulteriormente la parete cellulare, aggiungere un millilitro di soluzione di proteinasi K sul filtro in modo da coprire le cellule.Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare con PBS per ottenere strati singoli di DNA. Aggiungere un millilitro di soluzione di esonucleasi per coprire le cellule sul filtro.Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare il filtro facendo passare 10 millilitri di PBS attraverso il filtro sotto vuoto. Successivamente, tagliare i bordi del filtro per rimuovere la porzione priva di cellule.Quindi, su una superficie asciutta pulita con alcol, utilizzare una lama sterile per tagliare il filtro in otto pezzi di dimensioni uguali. Sono necessarie otto camere di incubazione con guarnizione a telaio; posizionare un ottavo del filtro in ciascuna camera di incubazione con guarnizione a telaio, con il lato del campione rivolto verso l'alto. Una volta assemblate le camere, utilizzare il kit di flusso per la proliferazione cellulare Roche Intu per rilevare in situ le cellule marcate con A-B-R-D-U.Una volta completate le procedure di incubazione, rimuovere la sezione del filtro dalla camera di incubazione e posizionarla su una superficie sterile; utilizzando una lama sterile, tagliare la sezione del filtro in piccoli pezzi. Trasferire i frammenti di filtro in una provetta microcentrifuga da due millilitri contenente un millilitro di PBS, chiudere ermeticamente la provetta e sigillarla con parafilm. Successivamente, incubare la provetta in un incubatore agitato a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto per 10 minuti.Dopo l'incubazione, fissare la provetta e vorticare alla velocità massima. Per cinque minuti, pipettare il sopranatante in una provetta sterile in polipropilene da 15 millilitri. Successivamente, risospendere il filtro in PBS e ripetere i passaggi di vorticosità e incubazione altre due volte, aggiungendo ogni volta il sopranatante alla stessa provetta da 15 millilitri per ogni campione.Conservare le cellule risospese a quattro gradi Celsius. Il campione deve essere analizzato mediante fax entro due giorni. Infine, separare le cellule per ottenere la popolazione con elevato livello di incorporazione di BRDU.Qui viene utilizzato un citometro a flusso BD fax area e il relativo software. Una volta che le cellule sono state ordinate, la popolazione arricchita in BRDU può essere analizzata per determinarne l'identità tassonomica. Per amplificare i geni dell'RNA ribosomiale 16S dei batteri filtrati, eseguire delle PCR: pipettare le cellule ordinate su un filtro in policarbonato bianco con porosità di 0,22 µm e, utilizzando una lama sterile, tagliare i bordi del filtro privi di cellule attivando la pompa a vuoto.Tagliare il filtro in quattro pezzi di dimensioni uguali per ogni condizione, posizionare un singolo pezzo di filtro in ciascuna delle tre provette per reazione PCR con le cellule rivolte verso l'interno della provetta. Aggiungere 45 microlitri di acqua per PCR. Lasciare che la sezione del filtro si immerga completamente nell'acqua.Successivamente, aggiungere due perle Roche illustra pure T ready to go PCR e vortexare brevemente per favorire la dissoluzione delle perle. Quindi aggiungere due microlitri ciascuno di primer forward e reverse del gene dell'RNA ribosomiale 16 s.Aggiungere un microlitro di BSA per aiutare ad assorbire gli inibitori dell'amplificazione oppure un microlitro di acqua. Eseguire l'amplificazione PCR su un termociclatore. Si raccomanda un programma di PCR con temperatura decrescente (touchdown), in cui la temperatura di annealing diminuisce progressivamente da 62 a 52 gradi Celsius di un grado Celsius per ciclo, seguito da 15 cicli a 52 gradi Celsius.Confermare l'amplificazione PCR mediante elettroforesi su gel all'1% di agarosio colorati con bromuro di etidio, escindere gli ampliconi PCR dal gel e purificarli utilizzando un kit di estrazione rapida da gel KaiGen cayo. Dopo la purificazione su gel PCR, raccogliere insieme gli ampliconi dello stesso campione. Gli ampliconi di DNA ribosomiale 16 s purificati sono ora pronti per diverse analisi molecolari.I campioni sono stati raccolti da un sito costiero della Georgia ed elaborati per studiare batteri degradanti la racina seguendo le procedure descritte in questo video. La racina è un composto poliammidico che può essere trovato ubiquitariamente negli ambienti marini. Può fungere da fonte di nutrimento ed energia per i batteri marini, come mostrato qui.L'analisi fattoriale dei campioni ha rivelato che, dopo un'incubazione di 24 ore, in microcosmi arricchiti con Racine si è sviluppato un gruppo di batteri con un livello più elevato di intensità di fluorescenza di FXI, positivamente correlato al grado di incorporazione di BRDU. Queste cellule sono state definite cellule con elevata incorporazione di BRDU o HI e si prevedeva che contenessero principalmente batteri degradatori di Racine. Nessun hi.Sono state trovate cellule nei controlli senza aggiunta, che contenevano solo cellule con livelli più bassi di incorporazione di BRDU, indicate come cellule lii, che si prevedeva contenessero principalmente plankton batterico non in grado di utilizzare. Le cellule Racine HI aggiunte sono state ordinate in provette separate e poi raccolte su filtri membrana. Degli ampliconi parziali del gene dell'RNA ribosomiale 16S sono stati ottenuti dopo la PCR su filtro e confermati mediante elettroforesi su gel.Dopo il filtraggio, può essere eseguita anche l'amplificazione mediante PCR di geni funzionali per esaminare la diversità funzionale tra le cellule ordinate. Ti abbiamo appena mostrato come separare fisicamente e identificare cellule batteriche funzionali in ambiente acquatico utilizzando un approccio che combina la citometria a flusso con attivazione fluorescente e l'incorporazione di BRDU. Ricorda, è obbligatorio indossare camice da laboratorio e guanti durante l'esecuzione di questa procedura.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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