Bromodeossiuridina (BrdU) Etichettatura e successive ordinamento fluorescenza cellulare attivo per la cultura indipendente Identificazione di carbonio organico disciolto-degradanti batterioplancton

I microbi mediano la degradazione di numerosi substrati di carbonio organico disciolto o composti DOC, come la Racine e gli ambienti acquatici. Per comprendere appieno il ruolo dei microbi nella trasformazione dei DOC, è necessaria l'identificazione simultanea della loro tassonomia e funzione. Questo video mostra una procedura per l'identificazione tassonomica di batteri viventi liberi o plancton batterico che trasformano specifici pool di DOC e ambienti acquatici.

I campioni d'acqua raccolti da un ambiente di test vengono elaborati e incubati con un composto di interesse e bromo deossiuridina, BRDU, che si incorpora nel DNA di nuova sintesi e nelle cellule in crescita attiva. Successivamente, il plancton batterico marcato con BRDU è marcato con anticorpi anti BRDU coniugati ZI. Il plancton batterico con alti livelli di marcatura BRDU viene isolato mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza.

Il DNA viene quindi estratto dalle cellule selezionate e l'identificazione tassonomica viene eseguita sulla base dei risultati dell'analisi genica dell'RNA ribosomiale 16 s basata sulla PCR. Ciao, mi chiamo Steven Robbins del laboratorio del Dr.Chen Mao nel Dipartimento di Scienze Biologiche della Kent State University. Oggi s lu ed io vi mostreremo un metodo indipendente dalla coltura per l'identificazione del plancton batterico DOC degradante in ambienti acquatici.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come gli ammendanti nutrizionali, seguiti dall'analisi sul DNA della comunità batterica, è che concentra l'analisi sui batteri altamente attivi ed esclude le cellule dormienti e a crescita lenta. Mostriamo qui l'identificazione dei batteri piantaggine che utilizzano uno specifico composto DOC. Ma questo metodo può essere applicato anche per studiare il plancton batterico che utilizza altri composti DOC singoli o gruppi di DLC come gli essudati algali.

Quindi prendiamo alcuni campioni d'acqua e iniziamo. Prima di prelevare campioni d'acqua per il plancton batterico DOC degradante, i campioni d'acqua devono essere adeguatamente elaborati. I campioni mostrati qui sono stati raccolti dalla costa della Georgia per rimuovere le particelle di grandi dimensioni e i VRE del ER dal campione d'acqua.

Utilizzare una pompa peristaltica per trasferire l'acqua dalla damigiana di raccolta a un'unità di filtrazione con un filtro a pori di un micrometro. Successivamente trasferire 36 millilitri di aliquote di filtrato in tre provette sterili di polipropilene da 50 millilitri. Ciascuno contiene quattro millilitri di soluzione di aldeide Paraform al 10% preparata al momento: incubare per due ore a temperatura ambiente per conservare le cellule dopo l'incubazione.

Versare l'acqua nella torre di filtrazione di un'unità di filtrazione sottovuoto in vetro con filtri a membrana bianca con pori di 0,22 micrometri e applicare il vuoto per far passare la soluzione. Lavare il filtro applicando 10 millilitri di PBS attraverso il filtro del vuoto. Etichettare i filtri come controlli negativi e conservarli a meno 20 gradi Celsius.

Per stabilire un ecosistema o microcosmo sperimentale, iniziare riempiendo sei fiasche di vetro pre-risciacquate da un litro con 800 millilitri di campione d'acqua pre-filtrata. Aggiungere BRDU a ciascun microcosmo fino a una concentrazione finale di 10 micromolari. Ruotare rapidamente il pallone a mano per mescolare.

Ogni campione sarà analizzato e triplicato. Quindi, a tre dei microcosmi, aggiungi il composto modello DOC. Qui la reina viene aggiunta ai microcosmi ad una concentrazione finale di 100 nanomolari.

Agli altri tre microcosmi si aggiunge poi la PBS sterile. Questi serviranno come controlli non DOC per posizionare tutti i microcosmi in un'incubatrice con agitazione a 100 giri/min al buio alla temperatura in situ, che è di 25 gradi Celsius. Qui a punti orari di 0, 8, 16 e 24 ore.

Raccogliere 36 millilitri da ciascun microcosmo in una provetta sterile in polipropilene da 50 millilitri contenente quattro millilitri di aldeide paraforma fresca al 10% incubata per due ore a temperatura ambiente per fissare le cellule. Successivamente, filtrare le cellule conservate attraverso filtri a membrana bianca con pori di 0,22 micrometri. Applicare 10 millilitri di PBS attraverso il filtro del vuoto per lavare via i residui di PFA.

Procedere immediatamente alla rilevazione immunologica in situ INS o conservare i filtri a meno 20 gradi Celsius per analizzare l'incorporazione di BRDU nel plancton batterico. Iniziare gettando i filtri del campione a temperatura ambiente per compromettere la parete cellulare batterica. Posizionare il filtro su un'unità di filtrazione, quindi pipettare un millilitro di soluzione di lisozima sul filtro per coprire le cellule e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.

Dopo l'incubazione, applicare un vuoto per rimuovere la soluzione. Una volta che la soluzione passa attraverso il filtro, lavare le celle aggiungendo 10 millilitri di PBS e applicare il vuoto. Quindi, per compromettere ulteriormente la parete cellulare, aggiungere un millilitro di soluzione di proteinasi K al filtro per coprire le cellule.

Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare con PBS per produrre DNA a strato singolo. Aggiungere un millilitro di soluzione esonucleasica per coprire le cellule sul filtro.

Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare il filtro facendo passare 10 millilitri di PBS attraverso il filtro sottovuoto. Quindi, taglia i bordi del filtro per rimuovere la parte che non ha celle.

Quindi, su una superficie asciutta pulita con alcol, utilizzare una lama sterile per tagliare il filtro in otto pezzi di uguali dimensioni. Per ogni campione sono necessarie otto camere di incubazione con guarnizione a telaio: posizionare un ottavo del filtro nella camera di incubazione con guarnizione a telaio assemblata con il lato del campione rivolto verso l'alto. Una volta assemblate le camere, utilizzare il kit di proliferazione cellulare Roche Intu per rilevare in situ le cellule marcate con A-B-R-D-U.

Una volta completate le procedure in piedi, rimuovere la sezione del filtro dalla camera di incubazione e posizionarla su una superficie sterile utilizzando una lama sterile, tagliare la sezione del filtro in piccoli pezzi. Trasferire i pezzi del filtro in una provetta da microcentrifuga da due millilitri contenente un millilitro di PBS, chiudere ermeticamente la provetta e sigillarla con paraforma. Quindi incubare la provetta in un'incubatrice agitata a 37 gradi Celsius e 200 giri/min per 10 minuti.

Dopo l'incubazione, fissare il tubo e agitarlo alla massima velocità. Per cinque minuti, pipettare il natante SUP in una provetta sterile in polipropilene da 15 millilitri. Quindi risospendere il filtro in PBS e ripetere le fasi di vortice e incubazione altre due volte, aggiungendo ogni volta la fetta alla stessa provetta da 15 millilitri per ogni campione.

Conservare le celle risospese a quattro gradi Celsius. Il campione deve essere analizzato via fax entro due giorni. Infine, ordina le celle per ottenere la popolazione con un alto livello di incorporazione di BRDU.

In questo caso, vengono utilizzati un citometro a flusso ad area fax BD e il software corrispondente. Una volta che le cellule sono state selezionate, la popolazione arricchita di BRDU può essere analizzata per determinarne l'identità tassonomica. Per amplificare i geni dell'RNA ribosomiale 16 s di una sorta di PCR con filtro batterico eseguita, pipettare le cellule selezionate su un filtro a membrana in policarbonato bianco con pori da 0,22 pori e accendere la pompa a vuoto utilizzando una lama sterile per tagliare i bordi liberi delle cellule del filtro.

Tagliare il filtro in quattro pezzi di uguali dimensioni per ogni condizione, posizionare un singolo pezzo di filtro in ciascuna delle tre provette di reazione PCR con le celle rivolte verso l'interno della provetta. Aggiungere 45 microlitri di acqua di grado PCR. Lasciare che la sezione del filtro si immerga completamente nell'acqua.

Quindi, aggiungere due perle Roche illustra pure T pronte all'uso per PCR a vortice brevemente per aiutare a sciogliere le perline. Quindi aggiungere due microlitri ciascuno di 16 s ribosomiale in avanti e in retromarcia. Primer genici a RNA.

Aggiungi un microlitro di BSA per aiutare ad assorbire gli inibitori dell'amplificazione o un microlitro d'acqua. Eseguire l'amplificazione PCR su un termociclatore. Si consiglia un programma di PCR touchdown, che prevede che la temperatura di inginocchiamento A diminuisca sequenzialmente da 62 a 52 gradi Celsius di un grado Celsius per ciclo, seguita da 15 cicli a 52 gradi Celsius.

Confermare l'amplificazione della PCR mediante elettroforesi su un C di gel Agros all'1% colorato con bromuro, asportare gli ampliconi PCR dal gel e pulire con un kit di estrazione rapida del gel KaiGen cayo. Dopo la purificazione con gel PCR, unire gli ampliconi dello stesso campione. Gli ampliconi di DNA ribosomiale purificato a 16 s sono ora pronti per una serie di analisi molecolari.

I campioni sono stati raccolti da un sito costiero della Georgia e processati per studiare i batteri degradanti della racina seguendo le procedure descritte in questo video. La racina è un composto poliamoroso che può essere trovato ovunque negli ambienti marini. Può fungere da fonte di nutrienti ed energia per i batteri marini, come mostrato qui.

L'analisi dei fatti dei campioni ha rivelato che dopo un'incubazione di 24 ore, un gruppo di batteri con un livello più elevato di intensità di fluorescenza FXI, che era positivamente correlato all'entità dell'incorporazione di BRDU, è stato sviluppato nei microcosmi modificati di Racine. Queste cellule sono state designate come celle ad alta incorporazione BRDU o HI e ci si aspettava che contenessero principalmente batteri degradanti la Racine. No ciao.

Le cellule sono state trovate nei controlli senza aggiunta, che contenevano solo cellule con livelli più bassi di incorporazione di BRDU, denominate cellule lii, che contenevano principalmente plancton batterico che non erano in grado di utilizzare. Le cellule di Racine HI aggiunte sono state ordinate in provette separate e quindi raccolte su filtri a membrana. Dopo PCR con filtro sono stati ottenuti 16 ampliconi genici dell'RNA ribosomiale parziali e confermati mediante elettroforesi su gel.

Dopo il filtro di smistamento, l'amplificazione PCR di geni funzionali può anche essere eseguita per esaminare la diversità funzionale tra le cellule selezionate. Abbiamo appena mostrato come separare fisicamente e identificare le cellule batteriche funzionali nell'ambiente acquatico utilizzando un approccio che accoppia la selezione cellulare attivata fluorescente e l'incorporazione di BRDU. Ricorda, BIDU è la testa a terra, un camice da laboratorio e un glos dovrebbero sempre essere indossati durante l'esecuzione di questa procedura.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.