Name: Correnti a singolo canale e Tonico GABA-attivati in fettine di cervello di ratto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-17T14:03:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Impara la tecnica patch-clamp per registrare correnti GABA-attivate a singolo canale in fettine di ippocampo di ratto. Questo metodo permette di distinguere i canali sinaptici ed extrasinaptici e studiare l'eccitabilità neuronale.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio svedese della ricerca, Università di Uppsala e Fredrik e Ingrid Thurings Foundation. ZJ tenuto una borsa di studio post-dottorato da EXODIAB e Sällskapet Svenska för Medicinsk Forskning. Ringraziamo Frank Lee per l&#39;assistenza tecnica.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;intera-cella corrente rappresenta l&#39;insieme delle correnti generate da canali attivi nella cella. La farmacologia specifica e cloruro di permeabilità dei canali GABAA permette di identificare le correnti associate a questi canali. La natura transitoria di attivazione di canali sinaptica e l&#39;attivazione tonica dei canali extrasinaptica permette di differenziare facilmente tra queste due popolazioni di canali GABAA espressi in un neurone. Tuttavia, solo con un singolo canale registrazioni si può studiare le proprietà cinetiche delle molecole canale che generano le correnti tonico. A differenza dei canali sinaptici che attivano entro 100 ms, i canali GABAA tonica sono attivati ​​con una latenza nella gamma di minuti dal momento GABA è applicata 4,7,15,16,17,18. Questa attivazione ritardata dei risultati canali che le proprietà del canale molti non possono essere studiate usando cellule intere registrazioni. Al canale singolo livello i diversi sotto-popolazioni di canali GABAA possono essere identificati sulla base di diverse proprietà funzionali e farmacologiche. Così, prendendo un vantaggio di ciò che le diverse configurazioni di patch-clamp hanno da offrire, è possibile studiare in dettaglio la funzione molecolare e farmacologia del GABA-attivati ​​i canali che generano le correnti toniche e sinaptica nei neuroni.

Diverse patch-clamp sistemi hardware e software sono disponibili e tutti funzionano utilizzando gli stessi principi di base. Nel nostro laboratorio usiamo gli amplificatori Axoclamp e il software PClamp (Molecular Devices, USA) per registrare e analizzare i nostri esperimenti. Un altro marchio popolare è amplificatori HEKA e software (HEKA Elektronik, Germania) Microforge: Narishige MF-830 (Giappone); Vibrotome: ad esempio Leica VT1200S (Germania) o Campden Strumenti vibrotome (UK); microscopio: Nikon Eclipse E600FN; Bagnomaria; Micromanipolatori: misura e micromanipolatori Narishige (Giappone); Estrattore: DMZ- universale (Germania) o Narishige PC-10 (Giappone). Elettrodo di vetro: GC150F-15 (Harvard Apparatus, UK).

correnti a singolo canale e tonico gaba-attivati ​​in fettine di cervello di ratto

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

Il GABA A canali sono presenti in tutti i neuroni e si trovano sia a sinapsi e al di fuori delle sinapsi dove generano correnti fasica e tonica, rispettivamente 4,5,6,7 Il GABA Un canale è un pentamerica GABA-dipendenti canale del cloro. Le subunità del canale sono raggruppati in 8 famiglie (α1-6, β1-3, γ1-3, δ, ε, θ, π e ρ). Due alfa, due beta e uno da 3 subunità ° modulo funzionale del canale 8. Unendo studi di sottotipo specifico GABA-attivati ​​monocanale molecole con studi tra cui tutte le popolazioni del GABA A canali nel neurone diventa possibile comprendere il meccanismo di base di inibizione neuronale e come viene modulato da agenti farmacologici. Usiamo il patch-clamp 9,10 per studiare le proprietà funzionali dei canali GABA A nei neuroni vivi in fettine di ippocampo cervello e registrare il singolo canale e cellule intere correnti. Abbiamo ulteriormente esaminare come i canali sono influenzati da differenti concentrazioni di GABA, altri farmaci e fattori intra ed extracellulare. Per informazioni dettagliate descrizione teorica e pratica del patch-clamp metodo si veda The Single-Channel Registrazioni a cura di B ed E Sakman Neher 10.

Usiamo il patch-clamp per misurare GABA-activated monocanale correnti (GABAA canali, recettori GABA) e le correnti sinaptiche e tonico che generano nei neuroni. L&#39;attivazione dei canali diminuisce l&#39;eccitabilità neuronale nella salute e nella malattia<sup&gt; 1,2,3,4</sup&gt;.

Correnti a singolo canale e Tonico GABA-attivati ​​in fettine di cervello di ratto

I canali $\text{GABA}_{\text{A}}$ sono presenti in tutti i neuroni e sono localizzati sia a livello delle sinapsi che al di fuori di esse, dove generano correnti fasiche e toniche, ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è registrare le correnti attivate dal GABA generate da singole molecole, la corrente di singolo canale, e da popolazioni specifiche di canali localizzati a livello delle sinapsi o al di fuori delle sinapsi. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando fette di cervello ippocampale di ratto e realizzando pipette da utilizzare per la tecnica del patch clamping. Come secondo passaggio, si attacca una pipetta alla membrana neuronale.Dopo la formazione di un sigillo giga, si ottiene la configurazione del patch clamp in modalità cellula-attaccata. Successivamente, applicare aspirazione alla pipetta. Una volta che questa penetra nella cellula, viene stabilita la configurazione del patch clamp in modalità cellula-intera.Si ottengono risultati che distinguono tra canali GABAA sinaptici ed extrasinaptici. Il vantaggio principale della tecnica del clamp a pipetta rispetto a metodi esistenti come l'EMIT è che consente di studiare le proprietà funzionali dei canali. Il metodo del patch clamp può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, come quali fattori determinano l'eccitabilità dei neuroni e come questa viene modulata e regolata finemente.Le implicazioni di questa tecnologia si estendono alla terapia e alla diagnosi di numerose malattie, poiché ogni cellula vivente dipende da canali ionici funzionanti correttamente per la sopravvivenza e per svolgere funzioni cellulari specializzate. A illustrare la procedura sarà Giant, ricercatore post-dottorato nel laboratorio, e Young Yin, uno studente laureato del laboratorio. Per iniziare la procedura, sacrificare un ratto Wistar di 16-22 giorni dopo la nascita mediante decapitazione e rimuovere rapidamente il cervello con una spatola. Tagliare il cervello lungo la linea mediana con una lama chirurgica.Successivamente, posizionare ciascun emisfero su un filtro Watman con la superficie tagliata rivolta verso la carta. Mettere una goccia di colla istantanea sul disco del campione e posizionare l'emisfero sopra di esso con la superficie tagliata rivolta verso il basso. Quindi inserire il disco del campione nella camera di taglio del vibratome riempita di ghiaccio freddo.Un CSF. Impostare lo spessore della sezione a 400 micrometri e iniziare a tagliare il cervello. Tagliare circa due millimetri di tessuto cerebrale fino a raggiungere l'ippocampo.Successivamente, posizionare le sezioni ippocampali in una piastra di Petri in vetro riempita con un liquido cerebrospinale (CSF). La piastra viene posta su uno sfondo nero per consentire una facile visualizzazione dell'ippocampo. Il passo successivo consiste nell'isolare l'ippocampo dal tessuto circostante utilizzando una lama chirurgica affilata.Attenzione a non spingere o tirare il tessuto dopo questo passaggio. Incubare le sezioni e la soluzione A CSF a 37 gradi Celsius per un'ora, quindi mantenerle a temperatura ambiente fino al termine degli esperimenti. Per le pipette di registrazione vengono utilizzate capillari di vetro borosilicato.Utilizzare un'estrattore automatico o manuale per pipette, ottenendo una resistenza di due-quattro megaohm per le registrazioni in configurazione "whole cell", oppure di otto-venti megaohm per le registrazioni di singoli canali. Lucidare la pipetta con lo stesso vetro borosilicato per le registrazioni di singoli canali. Mediante un microfuso, fondere il vetro borosilicato sul filo di platino per rendere la punta più liscia.Lucidare le pipette in questo modo crea pipette che formano sigilli più stabili e con resistenza maggiore rispetto alle pipette lucidate tramite il calore di un filo non rivestito o mediante un passaggio di lucidatura nel tiratore automatico. L'apparato per il patch clamp è costituito da un microscopio montato su un tavolo galleggiante e racchiuso in una gabbia di Faraday, un amplificatore, un convertitore analogico-digitale e un computer. Insieme, questi strumenti sono spesso indicati come un apparato per patch clamp.Ora inserire una pipetta nel supporto per pipetta e stringere il cappuccio per fissare la pipetta. P clamp viene utilizzato come software per la tecnica del patch clamping. Impostare l'amplificatore OC clamp 200 B su V clamp, guadagno a due, filtro a due chilohertz e potenziale di mantenimento a zero millivolt per creare una pressione positiva nella pipetta; soffiare aria nell'ugello collegato al tubo che si connette al supporto per pipetta.Quindi chiudere la valvola tra il boccaglio e il tubo. Assicurarsi che non ci sia alcuna perdita d'aria. Successivamente, abbassare la pipetta nella soluzione del bagno.Sullo schermo del computer in cui viene misurata la resistenza della pipetta, si vedrà un impulso generato da un treno di impulsi di cinque millivolt e un numero che indica la resistenza della pipetta. Numeri più piccoli corrispondono ad aperture maggiori della punta della pipetta e a pipette più grandi. Regolare l'offset della pipetta sull'amplificatore a zero.Utilizzare un ingrandimento di 10x sul microscopio per identificare la regione, oppure un ingrandimento di 60x. Per identificare un neurone parametale da patchare nelle sezioni di ippocampo, le cellule granulari del giro dentato, la regione dei corpi cellulari delle cellule parametali dell'area CA1 e la regione dei corpi cellulari delle cellule parametali dell'area CA3 appaiono ciascuna come una banda luminosa. Mettere a fuoco la pipetta in modo da poter vedere contemporaneamente la regione o la cellula e la pipetta.Guardando attraverso gli oculari del microscopio, posizionare la pipetta sopra la metà della regione utilizzando il regolatore di movimento grossolano e abbassare la pipetta fino a quando si trova appena sopra, ma a contatto con il tessuto. A questo punto, abbassare molto delicatamente la pipetta al centro della cellula o della regione utilizzando le impostazioni di movimento fine del manipolatore. Allo stesso tempo, osservare lo schermo del computer per monitorare la resistenza della pipetta.Continuare ad abbassare la pipetta finché la resistenza della pipetta non aumenta. Rilasciare la pressione positiva dalla pipetta aprendo la valvola. Questo crea un'aspirazione delicata e forma automaticamente il sigillo giga.Se il sigillo gigaseal non si forma, applicare una depressione al bocchino dove in precedenza è stata applicata la pressione positiva. A questo punto si è ottenuta la cosiddetta configurazione del patch clamp in modalità cell attached. Regolare la compensazione della capacità rapida e lenta per annullare il transitorio proveniente dalla pipetta e dal supporto della pipetta.Sullo schermo del computer si vedrà un tracciato di corrente piatto. Maggiore è il valore di GigE, migliore sarà il rapporto segnale-rumore nelle registrazioni di canale singolo effettuate con una configurazione del patch clamp in modalità cell attached per registrare correnti di canale singolo. Impostare il guadagno a 500 e la frequenza di campionamento dei dati a non meno di 100 microsecondi.Quindi registrare le correnti. Mantenere il volume della soluzione di bagnamento basso, in modo che copra appena la sezione, per minimizzare il rumore nelle registrazioni durante la registrazione in configurazione whole cell. Modificare il potenziale della pipetta a meno 60 millivolt o a un valore prossimo al potenziale di membrana a riposo.Nella configurazione con cellula attaccata, applicare un'aspirazione alla pipetta attraverso il tubo collegato al porta-pipetta. Allo stesso tempo, osservare le variazioni della resistenza e del transitorio di capacità sullo schermo del computer. Una volta che si è penetrati nella cellula.Quando ciò accade, ci si trova nella cosiddetta configurazione a cella intera o in modalità a cella intera. Lasciare che la soluzione nella pipetta si equilibri con l'interno della cellula per cinque-dieci minuti. Nel frattempo, tenere sotto controllo il valore della resistenza in serie.La corrente è trasportata dalle popolazioni di canali aperti nella membrana cellulare. Per dimostrare i singoli canali attivati dal GABA, il GABA viene aggiunto nella soluzione della pipetta poiché non può attraversare la membrana cellulare. Qui vengono mostrate le correnti di singolo canale attivate da una concentrazione di GABA di 20 nanomolari in una registrazione in configurazione cell-attached su un neurone granulare del giro dentato.La cellula è stata depolarizzata di 40 millivolt. La conduttanza massima del canale era di 44 picosiemens e la sua latenza di attivazione era di 2,63 minuti. Ecco un esempio di come distinguere le correnti gabaergiche attivate sinaptiche ed extrasinaptiche in base alla natura fasicca e tonica delle correnti.La corrente attraverso popolazioni di canali è stata registrata da neuroni ippocampali di ratto utilizzando il metodo del voltage clamp in configurazione whole cell per identificare correnti toniche e fasiche. 100 micromolar del antagonista gabaa SR 9 55 31 è stato applicato a un neurone del giro dentato come indicato in BA e a un neurone del ca trattato con insulina. Un neurone parametale, come indicato in BB, SR 9 55 31 ha bloccato i canali extrasinaptici e indotto uno spostamento nella corrente di base, rivelando così la corrente tonica.Una volta acquisita padronanza, ottenere una patch cell-attached e poi penetrare nella cellula per stabilire una patch whole-cell può essere eseguito entro due minuti. Seguendo questa procedura, è possibile effettuare la patch su altri tessuti come isolotti pancreatici intatti o su cellule isolate come linfociti o cellule in coltura.

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