Correnti a singolo canale e Tonico GABA-attivati ​​in fettine di cervello di ratto

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di registrare le correnti attivate dal GABA generate da singole molecole, dalla corrente a canale singolo e da specifiche popolazioni di canali situati nelle sinapsi o al di fuori delle sinapsi. Ciò si ottiene preparando prima fette di cervello di ratto ippocampale e facendo pipette da utilizzare per il clampaggio dei patch. In una seconda fase, una pipetta viene attaccata alla membrana neuronale.

Dopo la formazione di una giga seal, si ottiene la configurazione del morsetto patch attaccato alla cella. Quindi, applicare l'aspirazione alla pipetta. Una volta che si irrompe nella cella, viene stabilita la configurazione del patch clamp dell'intera cella.

Si ottengono risultati che differenziano tra canali gabaa sinaptici ed extrasinaptici. Il vantaggio principale della tecnica del morsetto per animali domestici si abbina ai metodi esistenti come l'emissione è che si studiano le proprietà funzionali dei canali. Il metodo del patch clamp può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come ad esempio cosa determina l'accettabilità dei neuroni e come viene modulata e messa a punto.

Le implicazioni di questa tecnologia si estendono alla terapia e alla diagnosi di molte malattie perché ogni cellula vivente dipende dal corretto funzionamento del canale ionico per la sopravvivenza e la funzione cellulare specializzata. A dimostrare la procedura saranno un gigantesco borsista post-dottorato in laboratorio e un giovane yin, uno studente laureato in laboratorio. Per iniziare questa procedura, sacrificare un ratto wistar postnatale di età compresa tra 16 e 22 giorni mediante decapitazione e rimuovere rapidamente il cervello con una spatola. Taglia il cervello lungo la linea mediana con una lama chirurgica.

Quindi, posiziona ogni emisfero su una carta da filtro watman con una superficie tagliata rivolta verso la carta. Metti una goccia di super colla sul disco del campione e posiziona l'emisfero sopra di esso con una superficie tagliata rivolta verso il basso. Quindi posizionare il disco del campione nella camera di taglio del vibratore che viene riempita di ghiaccio freddo.

Un liquido cerebrospinale. Imposta lo spessore della fetta a 400 micrometri e inizia a tagliare il cervello. Tagliare circa due millimetri di tessuto cerebrale fino a raggiungere l'ippocampo.

Quindi, metti le fette dell'ippocampo in una piastra di Petri di vetro riempita con un liquido cerebrospinale. La piastra è posizionata su uno sfondo nero per consentire una facile visualizzazione dell'ippocampo. Il passo successivo consiste nell'isolare l'ippocampo dal tessuto circostante utilizzando una lama chirurgica affilata.

Fare attenzione a non spingere o tirare il fazzoletto dopo. Incubare le fette e la soluzione di A CSF a 37 gradi Celsius per un'ora, quindi tenerle a temperatura ambiente fino al termine degli esperimenti. I capillari in vetro silicato di boro vengono utilizzati per le pipette patch.

Estrarre le pipette patch con un estrattore automatico o manuale per ottenere una resistenza da due a quattro mega ohm per le registrazioni di intere cellule, o da 8 a 20 mega ohm per le registrazioni a canale singolo. Lucidare la pipetta con lo stesso vetro silicato di boro per la registrazione a canale singolo. Usando una micro forgia, fondere il vetro silicato di boro sul filo di platino per rendere la punta più liscia.

La lucidatura delle pipette in questo modo crea pipette che formano guarnizioni più stabili e più resistenti rispetto alle pipette lucidate dal calore di un filo non rivestito o da una fase di lucidatura nell'estrattore automatico. L'attrezzatura del patch clamp è costituita da un microscopio su un tavolo galleggiante e racchiuso in una gabbia di Faraday, un amplificatore, un digitalizzatore e un computer. Insieme, queste apparecchiature sono spesso indicate come patch clamp rig.

Inserire ora una pipetta nel portapipetta e serrare il tappo per fissare la pipetta. Il morsetto P viene utilizzato come software di bloccaggio patch. Impostare l'amplificatore OC clamp da 200 B a V clamp, guadagnato a due, il filtro a due kilohertz e il potenziale di tenuta a zero millivolt per creare una pressione positiva nella pipetta e soffiare aria nel boccaglio che è collegato al tubo che si collega al supporto della pipetta.

Quindi chiudere la valvola tra il bocchino e il tubo. Assicurarsi che non vi siano perdite d'aria. Quindi, immergere la pipetta nella soluzione del bagno.

Sullo schermo del computer in cui viene misurata la resistenza della pipetta, vedrai un impulso generato da un treno di impulsi da cinque millivolt e un numero che ti dice la resistenza della pipetta. Numeri più piccoli rappresentano aperture più grandi per i puntali delle pipette e pipette più grandi. Regolare l'offset della pipetta sull'amplificatore su zero.

Utilizzare un ingrandimento 10x sul microscopio per identificare la regione o un ingrandimento 60x. Per identificare un neurone parametallico che si sta per applicare un patch nelle fette dell'ippocampo, le cellule del granulo del giro dentato, la regione del corpo cellulare parametallico CA one e la regione del corpo cellulare parametal CA tre appaiono ciascuna come una banda luminosa. Mettere a fuoco la pipetta in modo da poter vedere sia la regione o la cellula che la pipetta.

Quando si guarda attraverso gli oculari del microscopio, posizionare la pipetta sopra il centro della regione utilizzando l'impostazione del manipolatore a movimento grossolano e abbassare la pipetta fino a quando non si trova appena sopra, ma toccando il tessuto. A questo punto, abbassare la pipetta molto delicatamente al centro della cellula o della regione utilizzando le impostazioni di movimento fine del manipolatore. Allo stesso tempo, guardare lo schermo del computer per tenere traccia della resistenza della pipetta.

Continuare ad abbassare la pipetta fino a quando la resistenza della pipetta non aumenta. Rilasciare la pressione positiva dalla pipetta aprendo la valvola. Questo crea un'aspirazione delicata e forma automaticamente la tenuta giga.

Se la guarnizione giga non è formata, applicare l'aspirazione al bocchino dove è stata precedentemente applicata la pressione positiva. Ora avete ottenuto la cosiddetta configurazione del morsetto patch attaccato alla cella. Regolare la compensazione della capacità rapida e lenta per annullare il transitorio proveniente dalla pipetta e dal portapipetta.

Sullo schermo del computer, vedrai una traccia di corrente piatta. Più alto è il valore GigE, migliore sarà il rapporto segnale/rumore che si avrà nelle registrazioni a canale singolo per registrare correnti a canale singolo con una configurazione patch clamp collegata a una cella. Impostare il guadagno su 500 e la frequenza di campionamento dei dati su un valore non inferiore a 100 microsecondi.

Quindi registra le correnti. Mantieni basso il volume della soluzione del bagno in modo che copra solo la fetta per ridurre al minimo il rumore nelle registrazioni per eseguire la registrazione dell'intera cellula. Modificare il potenziale della pipetta a meno 60 millivolt o vicino al potenziale della membrana a riposo.

Nella configurazione con cella collegata, applicare l'aspirazione alla pipetta tramite il tubo collegato al supporto della pipetta. Allo stesso tempo, annotare le variazioni della resistenza e del transitorio di capacità sullo schermo del computer. Una volta che hai fatto irruzione nella cella.

Quando ciò accade, ci si trova nella cosiddetta configurazione a cella intera o modalità a cella intera. Lasciare che la soluzione della pipetta si equilibri con l'interno della cella per cinque-10 minuti. Nel frattempo, tieni traccia del valore della resistenza in serie.

La corrente è trasportata dalle popolazioni di canali aperti nella membrana cellulare. Per dimostrare l'attivazione del GABA a canali singoli, il GABA viene aggiunto alla soluzione della pipetta in quanto non può attraversare la membrana cellulare. Qui sono mostrate le correnti a canale singolo attivate dalla concentrazione di GABA a 20 nanomolari in un patch attaccato a una cellula su un neurone granulare di giro dentato.

Il cerotto è stato depolarizzato di 40 millivolt. La conduttanza massima del canale era di 44 Picos semens e la sua latenza di attivazione era di 2,63 minuti. Ecco un esempio di come differenziare le correnti gaba, sinaptiche attivate ed extrasinaptiche in base alla natura fasica e tonica delle correnti.

La corrente attraverso le popolazioni di canali è stata registrata dai neuroni dell'ippocampo di ratto utilizzando il metodo del voltage clamp dell'intera cellula per identificare le correnti toniche e fasiche. 100 micromolari dell'antagonista gabaa SR 9 55 31 sono stati applicati a un neurone del giro dentato come indicato in BA e a un ca trattato con insulina. Un neurone parametallico, come indicato in BB SR 9 55 31, ha bloccato i canali sinaptici extra e ha indotto uno spostamento della corrente di base, che ha rivelato la corrente tonica.

Una volta padroneggiato, ottenere un cerotto attaccato alla cellula e quindi irrompere nella cellula per stabilire un cerotto a cellula intera può essere fatto in due minuti. Seguendo questa procedura, si può applicare un cerotto su altri tessuti come occhielli pancreatici intatti o cellule isolate come linfociti o cellule in coltura.