Immobilizzazione batterica per Imaging di microscopia a forza atomica

La microscopia a forza atomica o la microscopia FM utilizzano il sondaggio meccanico di una superficie per generare immagini ad alta risoluzione senza la necessità di trattare chimicamente il campione. In questo video, i batteri vengono immobilizzati su mica rivestita di gelatina e ripresi in un ambiente liquido da un FM. I primi quadrati MICA vengono tagliati per adattarsi alla piattaforma del microscopio A FM. Lo strato superiore della MICA viene rimosso e i quadrati di mica vengono ricoperti di gelatina.

Successivamente, una gocciolina di sospensione batterica viene posta sulla mica rivestita di gelatina e spalmata. Utilizzando una punta di pipetta, i campioni vengono incubati per 10 minuti. Quindi i batteri non legati vengono lavati via dalla superficie.

Il campione viene posto nella cella umida A FM e sottoposto a imaging per ottenere immagini ad alta risoluzione di batteri vivi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la mobilizzazione del filtro poroso ISO, è che sia i batteri a forma di bastoncino che quelli sferici possono essere immobilizzati in modo affidabile. Inoltre, una percentuale maggiore della superficie cellulare è accessibile alla sonda A FM.

Un vantaggio chiave della microscopia a forza atomica rispetto ad altre microscopie è che è possibile condurre studi su singole cellule, indagini sulla morfologia cellulare, sulla formazione del setto e sulla citochinesi. Gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché tendono a utilizzare gelatina che non ha dimostrato di immobilizzare i batteri o i batteri usati cresciuti in un mezzo complesso in cui i componenti competeranno con l'adesione dei batteri alla superficie della gelatina. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta da esperimenti negli anni '70 in cui i batteri venivano immobilizzati.

Vetrini in vetro rivestiti di gelatina per esperimenti con microscopia ottica e autoradiografia. In questa dimostrazione, i batteri gram-negativi vivi vengono immobilizzati per un imaging FM, ma il metodo è applicabile anche ai batteri gram-positivi. Per preparare la MICA, iniziare tagliandola con le forbici per adattarla al tavolino del microscopio A FM e accogliere la cella umida A FM.

Quindi posizionare lo scotch sulla superficie della MICA e rimuoverlo per staccare lo strato esterno di MICA dal pezzo tagliato. Continuare a rimuovere lo strato esterno da entrambi i lati fino a quando rimangono solo strati lisci e ininterrotti. Per preparare la soluzione di gelatina, aggiungere 100 millilitri di acqua distillata in una bottiglia da laboratorio e scaldarla nel microonde.

Quando l'acqua inizia a bollire, toglietela dal microonde, aggiungete 0,5 grammi di gelatina e gonfiate delicatamente la bottiglia fino a quando la gelatina non si sarà sciolta. Si noti che le gelatine bovine non funzionano bene per questa procedura. Si consigliano gelatine suine.

Posiziona la bottiglia sul piano di lavoro e lasciala raffreddare a 60-70 gradi Celsius. Quindi versare una quantità sufficiente di soluzione di gelatina in un piccolo becher per garantire che la MICA possa essere immersa completamente con una pinza. Immergere un quadrato di MICA nella soluzione di gelatina calda e ritirarlo rapidamente. Immediatamente.

Posizionare la MICA sul bordo su un tovagliolo di carta appoggiato a una griglia per microcentrifuga per asciugare all'aria ambiente durante la notte. La MICA rivestita di gelatina può essere utilizzata per almeno due settimane. Se la gelatina ricoperta di MICA non verrà utilizzata per un paio di settimane.

Metterlo su carta da filtro in una capsula di Petri coperta e conservarlo a temperatura ambiente. La soluzione di gelatina in eccesso può essere conservata in frigorifero e utilizzata per circa un mese semplicemente riscaldando la soluzione madre a una temperatura compresa tra 60 e 70 gradi. È necessario prestare attenzione a Celsius per garantire che la gelatina non venga bollita durante il riscaldamento.

Prima di montare i batteri su MICA rivestita di gelatina, assicurarsi che la concentrazione batterica sia adeguata. Utilizzare uno spettrofotometro per ottenere una lettura della densità ottica del campione batterico a 600 nanometri. Un OD di 0,5 a uno è ottimale.

Quindi, trasferire un millilitro di coltura in una provetta da microcentrifuga e centrifugarla per pellettarla dopo la centrifugazione. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante, quindi lavare il pellet in un millilitro di acqua deionizzata filtrata o tampone. Pipettare delicatamente su e giù per riprendere.

Sospendi la centrifuga di pellet il tuo guadagno e riattiva prontamente il pellet. In 500 microlitri di acqua deionizzata nano pura, la sospensione batterica deve essere visibilmente svuotata per avere un'adeguata concentrazione di cellule. Per un'immagine FM.

Se lo shock osmotico è un problema, è possibile aggiungere 0,25 molari di saccarosio alla soluzione di imaging. Ho risospeso questo batterio in acqua, ma non aver paura di provare altri liquidi. Ad esempio, lo abbiamo fatto con lo 0,25% di saccarosio, quindi prova altri liquidi e vedi se funzionerà anche questo.

Preparare due vetrini per ogni campione. Utilizzando un micropipettatore, aggiungere da 10 a 20 microlitri di sospensione cellulare sulla superficie rivestita di gelatina. Quindi, per fornire un'area di copertura adeguata per un imaging FM, utilizzare una punta per micropipetta per diffondere la gocciolina sia in direzione X che Y.

Facendo attenzione a non toccare fisicamente la superficie della gelatina con la punta della pipetta, incubare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, sciacquare con un getto d'acqua per rimuovere il liquido in eccesso dal campione toccando il bordo del campione con un tovagliolo di carta o carta da filtro. Asciugare rapidamente uno dei vetrini utilizzando un getto di azoto gassoso.

Quindi ispezionare visivamente il vetrino. Una macchia opaca indica che i batteri non sono stati rimossi nella fase di lavaggio. L'altro vetrino, che verrà ora utilizzato per l'imaging, non deve essere lasciato asciugare.

Posizionarlo nel palco bagnato A FM e fissarlo utilizzando le clip, utilizzando una micropipetta aggiungere acqua al palco umido. È una buona idea preparare il microscopio a forza atomica prima dell'imaging in un liquido. Assicurarsi che il cantilever per l'imaging in liquido sia posizionato nell'A FM e sia allineato con il laser.

Procedere con l'imaging mediante microscopia a forza atomica utilizzando un microscopio a forza atomica pico plus, dotato di una testa di scansione da 100 micron e sonde in nitruro di silicio vico con costanti nominali della molla comprese tra 0,01 e 0,1 nano newton per nanometro. Una volta preparato il microscopio, inserire lo scanner FM e il tavolino nel microscopio. In genere, iniziamo da 0,5 linee al secondo fino a una riga al secondo come velocità di imaging e la risoluzione è impostata da 1 28 punti dati per linea a 512.

Impostare lo strumento per raccogliere immagini utilizzando da 128 a 512 pixel per riga. Scansione a una velocità di scansione da 0,5 a una riga al secondo. Quindi, se necessario, regolare il set point e i guadagni su A FM per ottenere immagini ottimali.

Infine, raccogli le immagini. I batteri E coli sono stati montati su MICA rivestita di gelatina come descritto in questo video e quindi ripresi in PVS molare da 0,005. Utilizzando questo metodo.

Gli scettri sono chiaramente visibili nell'immagine raccolta e le superfici cellulari sono lisce, senza mostrare segni di disidratazione. In confronto, le immagini scattate dello stesso e coli nell'aria, come mostrato qui, mostrano spesso strutture non visibili nel liquido. In questo caso, le cellule mostrano un aspetto anulare dovuto alla disidratazione e si possono vedere appendici batteriche come la FIA.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare campioni batterici per un imaging FM in un ambiente liquido. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora se le microsuperfici rivestite di gelatina sono state precedentemente preparate a letto. Quando si tenta questa procedura, è importante scegliere la gelatina corretta e avere una concentrazione appropriata di batteri Seguendo questa procedura.

È possibile eseguire altre misurazioni, come l'utilizzo del cantilever FN come strumento di rilevamento della forza per mantenere le misurazioni della forza sulle superfici batteriche. Inoltre, specifiche molecole della sonda possono essere collegate alla punta A FM per interagire con bersagli specifici sulla superficie batterica per identificare e misurare le forze di interazione. In genere non dimenticare che se stai lavorando con batteri patogeni, devi sempre prendere precauzioni quando lavori con questo metodo.