Name: Immobilizzazione batterica per Imaging di microscopia a forza atomica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Scopri l'immobilizzazione batterica per microscopia a forza atomica utilizzando mica rivestita con gelatina. Questo metodo consente l'imaging ad alta risoluzione di batteri Gram-negativi e Gram-positivi in ambiente liquido.

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Questa ricerca è patrocinato dall&#39;Ufficio di Ricerca Biologica e Ambientale, US Department of Energy e da concedere finanziamenti consiglio Salute Virginia ricerca del Commonwealth. Oak Ridge National Laboratory è gestito da UT-Battelle, LLC, per il Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti con il n. contratto DE-AC05-00OR22725.

1. Mica preparazione: <ol><li> Tagliare il mica (Scienze Microscopia Elettronica) con forbici per la dimensione necessaria per adattarsi al microscopio AFM (circa 22 × 30 mm). </li><li> Cleave la mica su entrambi i lati, in genere con del nastro per rimuovere lo strato più esterno, fino a solo strati liscio ininterrotta rimangono. </li></ol> 2. Preparazione della soluzione di gelatina: <ol><li> Aggiungere 100 ml di acqua distillata ad una bottiglia di laboratorio. </li><li> Riscaldare la bottiglia in un forno a microonde fino a quando l'acqua inizia a bollire. (Se un forno a microonde non è disponibile, l'acqua può essere riscaldata in un bicchiere su un piatto caldo.) </li><li> Pesare 0,5 grammi di gelatina (Sigma-G 6144, G-2625 o G-2500) e aggiungere l'acqua calda distillata. </li><li> Far ruotare delicatamente la bottiglia fino a quando la gelatina è completamente sciolta. </li><li> Raffreddare la soluzione di gelatina di 60-70 ° C. </li><li> Versare circa 15 ml in un bicchiere piccolo (20 ml) in cui la mica tagliare spaccati possono essere immersi. </li></ol> 3. Mica rivestimento: <ol><li> Immergere le piazze mica nella soluzione riscaldata gelatina e ritirare in fretta in modo che la mica è rivestito (Fig. 1a). </li><li> Dopo il rivestimento, il supporto mica subito, sul bordo, su un tovagliolo di carta per asciugare in aria ambiente (Fig. 1b). La mica gelatina rivestito può essere utilizzato per almeno 2 settimane. La soluzione di gelatina in eccesso può essere conservato in frigorifero e utilizzato per circa un mese con la semplice riscaldamento della soluzione di riserva compreso tra 60-70 ° C. Si deve prestare attenzione per assicurare che la gelatina non è bollito durante il riscaldamento. </li></ol> 4. Montaggio batteri su gelatina mica rivestiti: <ol><li> Pellet 1 ml di una coltura batterica (0,5-1,0 OD a 600 nm) a 800 a 4.500 rcf. A seconda del batterio, utilizzare il rcf minimo che agglomerare le cellule in ~ 5 minuti. </li><li> Lavare il pellet nello stesso volume di acqua deionizzata filtrata o buffer. </li><li> Raccogliere le cellule di nuovo per centrifugazione. </li><li> Risospendere il pellet tempestivamente in 500 ml di acqua deionizzata o Nanopure buffer. (La sospensione batterica deve essere visibilmente torbido in modo da avere una concentrazione sufficiente di cellule per l'imaging AFM). </li><li> Applicare la sospensione cellulare (10-20 mL) alla gelatina rivestite di mica e la diffusione sulla superficie con un puntale (fig. 1c). Si deve prestare attenzione a non toccare fisicamente la superficie di gelatina con la punta della pipetta durante l'applicazione o la diffusione della soluzione batterica. </li><li> Lasciare che la superficie a riposo per 10 minuti e sciacquare con un getto d'acqua o tampone (Fig. 1 cd). Nel corso della procedura, fare attenzione ad assicurare che il campione non è consentito ad asciugare. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: La figura 2 mostra immagini di esempio di cellule batteriche che sono state montate su gelatina rivestite di mica e ripreso da AFM. Nei nostri laboratori, i campioni sono in genere ripreso PicoPlus utilizzando un microscopio a forza atomica (Agilent Technologies, Tempio, AZ) dotato di una scansione 100 capi micron. Lo strumento è operato a 128-512 pixel per linea di scansione a una velocità di scansione di 0,5-1,0 linee / s. Il cantilever che sono tipicamente utilizzati sono Veeco sonde di nitruro di silicio (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) con costanti molla nominali che vanno dal 0,01-0,1 nN / nm. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Gelatina ad una temperatura di 60-70 ° C è posto in un bicchiere da 20 ml. Utilizzando un paio di pinzette appena spaccati piazze mica sono totalmente immersi nella gelatina (a), ritirato e messo in piedi su un tovagliolo di carta appoggiato a un rack centrifuga micro (b). Una goccia di campione batterica è posto sulla mica e diffuso con una punta di pipetta in entrambe le direzioni X e Y (c). Dopo aver lasciato il campione ad incubare in superficie mica per almeno 10 minuti, risciacquare il campione in un flusso di acqua distillata. Se l'immobilizzazione lavorato sarete in grado di vedere un luogo opaco sul mica come mostrato nel pannello di destra della (d). Se l'immobilizzazione non ha funzionato otterrete un pezzo di mica chiara, come nel pannello di sinistra. Lo spot opaco sulle scale mica alla concentrazione dei batteri nel droplet che si colloca sulla mica gelatina trattata. <img src="/files/ftp_upload/2880/2880fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Immagini AFM di E. coli. Nel grafico (a), le cellule sono montati su gelatina rivestite di mica e ripreso in 0.005 M PBS. Per confronto, l'immagine di cellule batteriche montate su gelatina rivestite di mica e ripreso in aria è mostrato nel grafico (b). Anche se setti sono chiaramente visibili in immagini raccolte in un liquido, una maggiore risoluzione, come indicato dalla presenza di pili (inserto del pannello (b)), può essere ottenuto in aria.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vari fattori possono influenzare cellule microbiche di montaggio e di imaging AFM. La gelatina che viene utilizzato per il rivestimento della mica è importante. Commerciale gelatina è isolata da un certo numero di vertebrati tra cui pesci, mucche e maiali. Sia l&#39;origine e il metodo di lavorazione determinare l&#39;idoneità della gelatina per l&#39;immobilizzazione dei batteri. Numerose fonti e tipi di gelatina sono stati valutati per la loro efficacia nei batteri immobilizzare [1]. I due gelatine più efficaci sono r...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> G6144, G2625 e G2500 </td></tr><tr><td> PicoPlus microscopio a forza atomica </td><td> Agilent Technologies, Tempe, AZ </td><td></td></tr><tr><td> Cantilever AFM </td><td> Veeco, Santa Barbara, CA </td><td> MLCT-AUHW </td></tr></tbody></table>

immobilizzazione batterica per imaging di microscopia a forza atomica

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM è ad alta risoluzione (scala nm) strumento di imaging che meccanicamente le sonde una superficie. Ha la capacità di celle di immagine e di biomolecole, in un ambiente liquido, senza la necessità di trattare chimicamente il campione. Al fine di realizzare questo obiettivo, il campione deve essere sufficientemente aderire alla superficie di montaggio per impedire la rimozione da parte delle forze esercitate dal punta di scansione cantilever AFM. In molti casi, l&#39;imaging di successo dipende immobilizzazione del campione alla superficie di montaggio. In modo ottimale, immobilizzazione deve essere minimamente invasiva per il campione in modo tale che i processi metabolici e gli attributi funzionali non vengano compromesse. Dalle superfici mica rivestimento appena aperto con suini (maiale) gelatina, i batteri con carica negativa può essere immobilizzato sulla superficie e ripreso in un liquido da AFM. Immobilizzazione di cellule batteriche in gelatina rivestita mica è molto probabilmente dovuto alla interazione elettrostatica tra i batteri con carica negativa e la gelatina con carica positiva. Diversi fattori possono interferire con l&#39;immobilizzazione dei batteri, tra cui costituenti chimici del liquido in cui sono sospesi i batteri, il tempo di incubazione dei batteri sulla gelatina rivestito mica, caratteristiche superficie del ceppo batterico e mezzo in cui sono esposte i batteri. Nel complesso, l&#39;uso di gelatina rivestite mica si trova ad essere generalmente applicabili per le cellule microbiche imaging.

Vivono batteri Gram-negativi e Gram-positivi possono essere immobilizzati su gelatina rivestite di mica e ripreso in un liquido mediante microscopia a forza atomica (AFM).

Immobilizzazione batterica per Imaging di microscopia a forza atomica

L'AFM è uno strumento di imaging ad alta risoluzione (scala nm) che sonda meccanicamente una superficie. È in grado di visualizzare cellule e biomolecole, in un liquido...

La microscopia a forza atomica o AFM utilizza una sonda meccanica della superficie per generare immagini ad alta risoluzione senza la necessità di trattare chimicamente il campione. In questo video, i batteri vengono immobilizzati su mica ricoperta di gelatina e osservati in un ambiente liquido mediante AFM. Innanzitutto, dei quadrati di mica vengono tagliati in modo da adattarsi alla piattaforma del microscopio AFM. Viene rimossa lo strato superficiale della mica e i quadrati di mica vengono ricoperti di gelatina.Successivamente, una goccia di sospensione batterica viene posta sul micaceo rivestito di gelatina e spalmata. Utilizzando la punta di una pipetta, i campioni vengono incubati per 10 minuti. Quindi, i batteri non legati vengono rimossi dalla superficie con un lavaggio.Il campione viene posizionato nella cella umida per AFM e immaginato per ottenere immagini ad alta risoluzione di batteri vivi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la mobilizzazione su filtro poroso ISO, è che sia i batteri a forma di bastoncello sia quelli sferici possono essere immobilizzati in modo affidabile. Inoltre, una percentuale maggiore della superficie cellulare è accessibile alla sonda AFM.Un vantaggio fondamentale della microscopia a forza atomica rispetto ad altre microscopie è che è possibile condurre studi su singole cellule, permettendo di indagare la morfologia cellulare, la formazione del setto e la citocinesi. I principianti di questo metodo incontrano difficoltà perché tendono a utilizzare gelatina non dimostrata efficace nel fissare i batteri oppure batteri coltivati in un mezzo complesso, i cui componenti competono con l'adesione dei batteri alla superficie di gelatina. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo da esperimenti risalenti agli anni '70 in cui i batteri venivano immobilizzati.Vetrini di vetro rivestiti con gelatina per esperimenti mediante microscopia ottica e autoradiografia. In questa dimostrazione, batteri vivi Gram-negativi vengono immobilizzati per un'analisi mediante microscopia a forza atomica (FM), ma il metodo è applicabile anche ai batteri Gram-positivi. Per preparare la MICA, iniziare tagliandola con le forbici in modo da adattarla al piatto del microscopio a forza atomica (A FM) e alloggiare la cella umida A FM.Successivamente, applicare del nastro adesivo sulla superficie della MICA e rimuoverlo per staccare lo strato esterno della MICA dal pezzo tagliato. Continuare a rimuovere lo strato esterno da entrambi i lati finché non rimangono soltanto strati lisci e integri. Per preparare la soluzione di gelatina, aggiungere 100 millilitri di acqua distillata in un contenitore da laboratorio e riscaldarla in un forno a microonde.Quando l'acqua inizia a bollire, rimuoverla dal forno a microonde, aggiungere 0,5 grammi di gelatina e agitare delicatamente il flacone fino a quando la gelatina si sarà sciolta. Si noti che le gelatine bovine non funzionano bene per questa procedura. Si raccomandano gelatine suine.Posizionare la bottiglia sul banco del laboratorio e lasciarla raffreddare a 60-70 gradi Celsius. Versare quindi una quantità sufficiente della soluzione di gelatina in un piccolo becher, in modo da garantire che la MICA possa essere completamente immersa utilizzando pinzette. Immergere un quadrato di MICA nella soluzione di gelatina calda ed estrarlo rapidamente. Immediatamente.Posizionare la MICA verticalmente su un tovagliolo di carta, appoggiata su una rack per microcentrifuga, e lasciarla asciugare all'aria ambiente durante la notte. La MICA rivestita con gelatina può essere utilizzata per almeno due settimane. Se la MICA rivestita con gelatina non dovrà essere utilizzata per alcune settimane.Posizionarlo su carta da filtro in una capsula di Petri coperta e conservare a temperatura ambiente. La soluzione di gelatina in eccesso può essere conservata in frigorifero e utilizzata per circa un mese semplicemente riscaldando la soluzione madre tra 60 e 70 gradi. È necessario fare attenzione a non far bollire la gelatina durante il riscaldamento.Prima di allestire i batteri su MICA rivestita di gelatina, assicurarsi che la concentrazione batterica sia adeguata. Utilizzare uno spettrofotometro per ottenere una lettura della densità ottica del campione batterico a 600 nanometri. Un OD compreso tra 0,5 e 1 è ottimale.Successivamente, trasferire un millilitro della coltura in una provetta da microcentrifuga e centrifugare per ottenere il pellet, seguendo la centrifugazione. Utilizzare una pipetta per rimuovere il sopranatante, quindi lavare il pellet con un millilitro di acqua deionizzata filtrata o tampone. Pipettare delicatamente su e giù per risospendere.Sospendere il pellet mediante centrifugazione e risospendere immediatamente il pellet in 500 microlitri di acqua deionizzata nano pure. La sospensione batterica deve apparire visibilmente torbida per garantire una concentrazione adeguata di cellule. Per un'analisi mediante microscopia a fluorescenza.Se si teme uno shock osmotico, si può aggiungere saccarosio 0,25 molare alla soluzione di imaging. Ho sospeso questi batteri in acqua, ma non esiti a provare altri liquidi. Ad esempio, abbiamo ottenuto risultati con saccarosio 0,25%, quindi provi altri liquidi e verifichi se funzionano altrettanto bene.Preparare due vetrini per ogni campione. Utilizzando una micropipetta, aggiungere da 10 a 20 microlitri di sospensione cellulare sulla superficie rivestita con gelatina. Successivamente, per ottenere un'area di copertura adeguata per l'imaging in microscopia a fluorescenza (FM), utilizzare la punta di una micropipetta per spalmare la goccia sia nella direzione X che in quella Y.Senza toccare fisicamente la superficie di gelatina con la punta della pipetta, incubare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, risciacquare con un flusso di acqua ed eliminare il liquido in eccesso toccando il bordo del campione con un tovagliolo di carta o carta da filtro. Asciugare rapidamente uno dei vetrini utilizzando un getto di gas azoto.Quindi ispezionare visivamente il vetrino. Una macchia opaca indica che i batteri non sono stati rimossi durante il passaggio di lavaggio. L'altro vetrino, che ora verrà utilizzato per l'acquisizione delle immagini, non deve essere lasciato asciugare.Posizionarlo sul portacampioni umido A FM e fissarlo utilizzando le clip; con una pipetta microlitrica aggiungere acqua sul portacampioni umido. È consigliabile preparare il microscopio a forza atomica prima dell'acquisizione di immagini in liquido. Assicurarsi che la mensola per l'immagine in liquido sia inserita nell'A FM e allineata con il laser.Procedere con l'acquisizione di immagini mediante microscopia a forza atomica utilizzando un microscopio a forza atomica Pico Plus, dotato di una testa di scansione da 100 micron e sonde in nitruro di silicio Vico con costanti elastiche nominali comprese tra 0,01 e 0,1 nano newton per nanometro. Una volta preparato il microscopio, inserire nello strumento lo scanner FM e il supporto. Tipicamente, si inizia con una velocità di acquisizione compresa tra 0,5 linee al secondo e una linea al secondo, mentre la risoluzione viene impostata da 128 a 512 punti dati per linea.Impostare lo strumento per acquisire immagini utilizzando da 128 a 512 pixel per riga. Eseguire la scansione a una velocità compresa tra 0,5 e una riga al secondo. Successivamente, se necessario, regolare il punto di settaggio e i guadagni sull'A FM per ottenere immagini ottimali.Infine, acquisire le immagini. I batteri E coli sono stati depositati su MICA rivestita di gelatina come descritto in questo video, e successivamente analizzati in PVS 0,005 molar. Utilizzando questo metodo.Le sceptre sono chiaramente visibili nell'immagine acquisita e le superfici cellulari sono lisce, senza segni di disidratazione. Per confronto, le immagini dello stesso e coli scattate in aria, come mostrato qui, mostrano spesso strutture non visibili in liquido. In questo caso, le cellule presentano un aspetto ad anello dovuto alla disidratazione e appendici batteriche come FIA possono essere osservate.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare campioni batterici per l'immagine in microscopia a fluorescenza (FM) in un ambiente liquido. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora, a condizione che le microsuperfici rivestite di gelatina siano state precedentemente preparate. Quando si esegue questa procedura, è importante scegliere il tipo corretto di gelatina e utilizzare una concentrazione appropriata di batteri seguendo questo protocollo.È possibile effettuare altre misurazioni, ad esempio utilizzando la mensola della FN come strumento di rilevamento della forza per ottenere misure di forza sulle superfici batteriche. Inoltre, molecole sonda specifiche possono essere ancorate alla punta del microscopio a forza atomica (AFM) per interagire con bersagli specifici sulla superficie batterica, al fine di identificare e misurare le forze di interazione. In generale, non bisogna mai dimenticare che, quando si lavora con batteri patogeni, è sempre necessario adottare precauzioni durante l'applicazione di questo metodo.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Un tapping mode microscopio a forza atomica (AFM), metodo per la visualizzazione di DNA plasmidico, proteine ​​citoplasmatiche, e DNA-proteina complessi è descritta. Il metodo include approcci alternativi per la preparazione di campioni per l'imaging AFM seguenti manipolazione biochimica. Specifiche regioni di DNA che contiene le proteine ​​che interagiscono sono osservati in quasi fisiologico condizioni di buffer.

Visualizzazione del DNA ricombinante e Complessi proteina usando la microscopia a forza atomica

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Atomic Force Microscopy to Visualize Phage–Antigen Interactions

Vi presentiamo un metodo per ottenere immagini a risoluzione sub-nanometrica con (modalità tapping) modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in un liquido. Il metodo è dimostrata su microscopi commerciali a forza atomica. Spieghiamo la logica alla base delle nostre scelte di parametri e di suggerire strategie per l'ottimizzazione risoluzione.

Sub-nanometrica Resolution Imaging con modulazione di ampiezza in microscopia a forza atomica in Liquid

Questo protocollo descrive l'immobilizzazione covalente di proteine con un eterobifunzionali silanico per superfici di ossido di silicio progettati per la spettroscopia della forza singola molecola basata di microscopia forza atomica che è esemplificato dalla interazione di RrgA (adesina pilus-1 punta di S. pneumoniae) con fibronectina.

Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

Descriviamo una semplice procedura litografica per l'immobilizzazione di molecole di DNA del gene-lunghezza su una superficie, che può essere utilizzata per eseguire gli esperimenti di espressione del gene senza cellula il biochip.

Superficie-immobilizzazione funzionale dei geni usando Multistep Strand Displacement Litografia

Presentiamo un protocollo per funzionalizzare i cantilever a forza atomica (AFM) con una singola cellula T e particelle di perline per studi immunologici. Vengono mostrate le procedure per sondare il legame di cellula-cellula T a una singola coppia da parte di AFM e per monitorare la risposta cellulare in tempo reale dei macrofagi a una singola particella solida da AFM con imaging a fluorescenza.

Funzionalizzazione dei cantilever a microscopio a forza atomica con cellule A T singole o a particella singola per la spettroscopia immunologica a forza a cella singola

Questo protocollo mira ad automatizzare le misurazioni AFM su centinaia di cellule microbiche. In primo luogo, i microbi vengono immobilizzati nelle microstrutture di francobolli PDMS e quindi le misurazioni della spettroscopia di forza vengono eseguite automaticamente su centinaia di cellule immobilizzate.

Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans

Qui è presentato il protocollo della tecnica Conpokal, che combina microscopia a forza confocale e atomica in un'unica piattaforma di strumenti. Conpokal fornisce la stessa cellula, la stessa regione, vicino all'imaging confocale simultaneo e alla caratterizzazione meccanica di campioni biologici vivi.

Microscopia confocale e a forza atomica (Conpokal) quasi simultanea su cellule vive

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) fornisce una potente piattaforma per studi batterici, consentendo di raggiungere una risoluzione su scala nanometrica. Sia la mappatura dei cambiamenti subcellulari (ad esempio, sulla divisione cellulare) che gli studi comparativi della composizione chimica (ad esempio, derivanti dalla resistenza ai farmaci) possono essere condotti a livello di singola cellula nei batteri.

Microscopia a forza atomica combinata con la spettroscopia infrarossa come strumento per sondare la chimica del singolo batterio

Qui, presentiamo l'applicazione della microscopia a forza atomica (AFM) come metodo semplice e veloce per la caratterizzazione batterica e analizziamo dettagli come la dimensione e la forma batterica, i biofilm di coltura batterica e l'attività delle nanoparticelle come battericidi.

Modalità di contatto Microscopia a forza atomica come tecnica rapida per l'osservazione morfologica e l'analisi del danno cellulare batterico

Scopri l'immobilizzazione batterica per microscopia a forza atomica utilizzando mica rivestita con gelatina. Questo metodo consente l'imaging ad alta risoluzione di batteri Gram-negativi e Gram-positivi in ambiente liquido.

Immobilizzazione batterica per Imaging di microscopia a forza atomica

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