Immobilizzazione batterica per Imaging di microscopia a forza atomica

La microscopia a forza atomica o AFM utilizza una sonda meccanica della superficie per generare immagini ad alta risoluzione senza la necessità di trattare chimicamente il campione. In questo video, i batteri vengono immobilizzati su mica ricoperta di gelatina e osservati in un ambiente liquido mediante AFM. Innanzitutto, dei quadrati di mica vengono tagliati in modo da adattarsi alla piattaforma del microscopio AFM. Viene rimossa lo strato superficiale della mica e i quadrati di mica vengono ricoperti di gelatina.

Successivamente, una goccia di sospensione batterica viene posta sul micaceo rivestito di gelatina e spalmata. Utilizzando la punta di una pipetta, i campioni vengono incubati per 10 minuti. Quindi, i batteri non legati vengono rimossi dalla superficie con un lavaggio.

Il campione viene posizionato nella cella umida per AFM e immaginato per ottenere immagini ad alta risoluzione di batteri vivi. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la mobilizzazione su filtro poroso ISO, è che sia i batteri a forma di bastoncello sia quelli sferici possono essere immobilizzati in modo affidabile. Inoltre, una percentuale maggiore della superficie cellulare è accessibile alla sonda AFM.

Un vantaggio fondamentale della microscopia a forza atomica rispetto ad altre microscopie è che è possibile condurre studi su singole cellule, permettendo di indagare la morfologia cellulare, la formazione del setto e la citocinesi. I principianti di questo metodo incontrano difficoltà perché tendono a utilizzare gelatina non dimostrata efficace nel fissare i batteri oppure batteri coltivati in un mezzo complesso, i cui componenti competono con l'adesione dei batteri alla superficie di gelatina. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo da esperimenti risalenti agli anni '70 in cui i batteri venivano immobilizzati.

Vetrini di vetro rivestiti con gelatina per esperimenti mediante microscopia ottica e autoradiografia. In questa dimostrazione, batteri vivi Gram-negativi vengono immobilizzati per un'analisi mediante microscopia a forza atomica (FM), ma il metodo è applicabile anche ai batteri Gram-positivi. Per preparare la MICA, iniziare tagliandola con le forbici in modo da adattarla al piatto del microscopio a forza atomica (A FM) e alloggiare la cella umida A FM.

Successivamente, applicare del nastro adesivo sulla superficie della MICA e rimuoverlo per staccare lo strato esterno della MICA dal pezzo tagliato. Continuare a rimuovere lo strato esterno da entrambi i lati finché non rimangono soltanto strati lisci e integri. Per preparare la soluzione di gelatina, aggiungere 100 millilitri di acqua distillata in un contenitore da laboratorio e riscaldarla in un forno a microonde.

Quando l'acqua inizia a bollire, rimuoverla dal forno a microonde, aggiungere 0,5 grammi di gelatina e agitare delicatamente il flacone fino a quando la gelatina si sarà sciolta. Si noti che le gelatine bovine non funzionano bene per questa procedura. Si raccomandano gelatine suine.

Posizionare la bottiglia sul banco del laboratorio e lasciarla raffreddare a 60-70 gradi Celsius. Versare quindi una quantità sufficiente della soluzione di gelatina in un piccolo becher, in modo da garantire che la MICA possa essere completamente immersa utilizzando pinzette. Immergere un quadrato di MICA nella soluzione di gelatina calda ed estrarlo rapidamente. Immediatamente.

Posizionare la MICA verticalmente su un tovagliolo di carta, appoggiata su una rack per microcentrifuga, e lasciarla asciugare all'aria ambiente durante la notte. La MICA rivestita con gelatina può essere utilizzata per almeno due settimane. Se la MICA rivestita con gelatina non dovrà essere utilizzata per alcune settimane.

Posizionarlo su carta da filtro in una capsula di Petri coperta e conservare a temperatura ambiente. La soluzione di gelatina in eccesso può essere conservata in frigorifero e utilizzata per circa un mese semplicemente riscaldando la soluzione madre tra 60 e 70 gradi. È necessario fare attenzione a non far bollire la gelatina durante il riscaldamento.

Prima di allestire i batteri su MICA rivestita di gelatina, assicurarsi che la concentrazione batterica sia adeguata. Utilizzare uno spettrofotometro per ottenere una lettura della densità ottica del campione batterico a 600 nanometri. Un OD compreso tra 0,5 e 1 è ottimale.

Successivamente, trasferire un millilitro della coltura in una provetta da microcentrifuga e centrifugare per ottenere il pellet, seguendo la centrifugazione. Utilizzare una pipetta per rimuovere il sopranatante, quindi lavare il pellet con un millilitro di acqua deionizzata filtrata o tampone. Pipettare delicatamente su e giù per risospendere.

Sospendere il pellet mediante centrifugazione e risospendere immediatamente il pellet in 500 microlitri di acqua deionizzata nano pure. La sospensione batterica deve apparire visibilmente torbida per garantire una concentrazione adeguata di cellule. Per un'analisi mediante microscopia a fluorescenza.

Se si teme uno shock osmotico, si può aggiungere saccarosio 0,25 molare alla soluzione di imaging. Ho sospeso questi batteri in acqua, ma non esiti a provare altri liquidi. Ad esempio, abbiamo ottenuto risultati con saccarosio 0,25%, quindi provi altri liquidi e verifichi se funzionano altrettanto bene.

Preparare due vetrini per ogni campione. Utilizzando una micropipetta, aggiungere da 10 a 20 microlitri di sospensione cellulare sulla superficie rivestita con gelatina. Successivamente, per ottenere un'area di copertura adeguata per l'imaging in microscopia a fluorescenza (FM), utilizzare la punta di una micropipetta per spalmare la goccia sia nella direzione X che in quella Y.

Senza toccare fisicamente la superficie di gelatina con la punta della pipetta, incubare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, risciacquare con un flusso di acqua ed eliminare il liquido in eccesso toccando il bordo del campione con un tovagliolo di carta o carta da filtro. Asciugare rapidamente uno dei vetrini utilizzando un getto di gas azoto.

Quindi ispezionare visivamente il vetrino. Una macchia opaca indica che i batteri non sono stati rimossi durante il passaggio di lavaggio. L'altro vetrino, che ora verrà utilizzato per l'acquisizione delle immagini, non deve essere lasciato asciugare.

Posizionarlo sul portacampioni umido A FM e fissarlo utilizzando le clip; con una pipetta microlitrica aggiungere acqua sul portacampioni umido. È consigliabile preparare il microscopio a forza atomica prima dell'acquisizione di immagini in liquido. Assicurarsi che la mensola per l'immagine in liquido sia inserita nell'A FM e allineata con il laser.

Procedere con l'acquisizione di immagini mediante microscopia a forza atomica utilizzando un microscopio a forza atomica Pico Plus, dotato di una testa di scansione da 100 micron e sonde in nitruro di silicio Vico con costanti elastiche nominali comprese tra 0,01 e 0,1 nano newton per nanometro. Una volta preparato il microscopio, inserire nello strumento lo scanner FM e il supporto. Tipicamente, si inizia con una velocità di acquisizione compresa tra 0,5 linee al secondo e una linea al secondo, mentre la risoluzione viene impostata da 128 a 512 punti dati per linea.

Impostare lo strumento per acquisire immagini utilizzando da 128 a 512 pixel per riga. Eseguire la scansione a una velocità compresa tra 0,5 e una riga al secondo. Successivamente, se necessario, regolare il punto di settaggio e i guadagni sull'A FM per ottenere immagini ottimali.

Infine, acquisire le immagini. I batteri E coli sono stati depositati su MICA rivestita di gelatina come descritto in questo video, e successivamente analizzati in PVS 0,005 molar. Utilizzando questo metodo.

Le sceptre sono chiaramente visibili nell'immagine acquisita e le superfici cellulari sono lisce, senza segni di disidratazione. Per confronto, le immagini dello stesso e coli scattate in aria, come mostrato qui, mostrano spesso strutture non visibili in liquido. In questo caso, le cellule presentano un aspetto ad anello dovuto alla disidratazione e appendici batteriche come FIA possono essere osservate.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare campioni batterici per l'immagine in microscopia a fluorescenza (FM) in un ambiente liquido. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora, a condizione che le microsuperfici rivestite di gelatina siano state precedentemente preparate. Quando si esegue questa procedura, è importante scegliere il tipo corretto di gelatina e utilizzare una concentrazione appropriata di batteri seguendo questo protocollo.

È possibile effettuare altre misurazioni, ad esempio utilizzando la mensola della FN come strumento di rilevamento della forza per ottenere misure di forza sulle superfici batteriche. Inoltre, molecole sonda specifiche possono essere ancorate alla punta del microscopio a forza atomica (AFM) per interagire con bersagli specifici sulla superficie batterica, al fine di identificare e misurare le forze di interazione. In generale, non bisogna mai dimenticare che, quando si lavora con batteri patogeni, è sempre necessario adottare precauzioni durante l'applicazione di questo metodo.