Il rilevamento del virus infettivo da Campo-zanzare raccolte mediante test coltura cellulare Vero

L'obiettivo generale di questa procedura è lo screening di zanzare raccolte sul campo per rilevare infezioni virali mediante saggio di coltura cellulare su cellule Vero. Innanzitutto, le zanzare raccolte sul campo vengono separate in base alla specie. Successivamente, le zanzare vengono omogeneizzate utilizzando un mulino agitatore.

Dopo aver preparato gli omogenati di zanzare, le cellule Vero vengono coltivate in previsione dei test virali; ogni coltura di cellule Vero viene quindi inoculata con un singolo omogenato di zanzara, posto su un agitatore per cinque minuti e poi incubato a 37 gradi Celsius per consentire la propagazione dei virus. Infine, le colture vengono esaminate visivamente alla ricerca di evidenze di effetti citopatici indotti dai virus. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la R-T-P-C-R, è che consente di analizzare le zanzare per una vasta diversità di agenti virali capaci di crescere in coltura cellulare.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della entomologia medica, ad esempio aiutando a chiarire i ruoli svolti da diverse specie di zanzare nel favorire la trasmissione dei virus. Utilizzare un laboratorio di sicurezza biologica di livello due per la seguente procedura. Collocare il sacchetto contenente le zanzare vive a meno 20 gradi Celsius per 15 minuti per anestetizzarle.

Dopo che gli insetti sono stati anestetizzati, trasferire il sacchetto in un contenitore isolante contenente ghiaccio secco ed esporre le zanzare all'anidride carbonica per uno-tre minuti per garantire un abbattimento completo. Successivamente, posizionare le zanzare su un piatto precedentemente raffreddato disposto su un letto di ghiaccio secco. Utilizzando pinzette a punta fine, identificare gli insetti femmina e trasferirli in contenitori di plastica monoporzione.

Le femmine possono essere distinte dai maschi esaminando le parti boccali e le antenne. Sigillare i contenitori e posizionarli su ghiaccio bagnato. Utilizzare un microscopio stereoscopico montato su un tavolo refrigerato elettronicamente e una chiave tassonomica.

Identificare la specie di ciascun pool di zanzare, raggruppando individui della stessa specie in vial da due millilitri con tappo a scatto etichettati, contenenti una sfera di rame. Fino a 50 individui possono essere raggruppati in un singolo tubo man mano che si riempiono. Posizionare i vial in sacchetti etichettati all'interno di un contenitore in polistirolo su ghiaccio secco.

Dopo aver identificato tutti i campioni di zanzare, questi possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius fino all'omogeneizzazione. Utilizzare un'installazione di livello di sicurezza biologica tre per questa procedura e lavorare all'interno di una cappa di sicurezza biologica di classe due. Aggiungere circa un millilitro di PBSG per ogni provetta e inserire le provette contenenti le zanzare in una cassetta pre-raffreddata per macinatore a sfera.

Fissare la cassetta caricata in un mulino miscelatore e omogeneizzare i pool di zanzare per quattro minuti a 25 cicli al secondo. Una volta omogeneizzate le zanzare, trasferire le provette in una microcentrifuga refrigerata a tenuta di aerosol e centrifugare. L'omogeneato di zanzare a 7.000 giri al minuto per sei minuti.

I tubi dopo la centrifugazione possono essere conservati a meno 80 gradi Celsius fino al test del virus. Versare il mezzo di coltura da una fiala T175 di cellule di suino confluenti in un becher per rifiuti contenente candeggina. Aggiungere cinque millilitri di PBS nella fiala e lavare uniformemente le cellule prima di versare il PBS nel becher per rifiuti.

Dopo aver lavato le cellule, aggiungere 2,5 millilitri di tripsina EDTA e incubare il fiasco a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per cinque minuti per staccare le cellule. Una volta staccate le cellule, aggiungere cinque millilitri di MEM e pipettare le cellule su e giù diverse volte per rompere eventuali aggregati. Quindi aggiungere altri 15 millilitri di MEM.

Posizionare 40 fiasche T 25 su due griglie all'interno della cappa a sicurezza biologica e rimuovere i tappi delle fiasche, ponendoli direttamente davanti a ciascuna fiasca; utilizzando una pipetta sterile, aliquotare quattro millilitri di MEM in ogni fiasca. Successivamente aggiungere 0,5 millilitri di cellule vari sospese e tappare le fiasche. Accatastare le fiasche su un vassoio e agitarle delicatamente per assicurarsi che il mezzo ricopra uniformemente il fondo delle fiasche.

Incubare le colture a 37 gradi Celsius e 5% CO2 durante la notte o fino a quando le cellule raggiungono una confluenza dell'80-90%. Rimuovere 20 fiasche piccole dall'incubatore ed etichettarle con il numero di accessione corrispondente di ciascun pool di zanzare. Decantare la maggior parte del mezzo da ogni fiasca nel contenitore dei rifiuti, lasciando solo il quantitativo sufficiente a ricoprire il monostrato cellulare.

Trasferire 100 microlitri di supernatante da ciascun omogenato di zanzara nel flacone corrispondentemente etichettato e sigillare ermeticamente i flaconi. Dopo aver trasferito i supernatanti, posizionare i flaconi su un agitatore impostato a 35-40 RRP M per cinque minuti. Riportare i flaconi all'interno della cappa a sicurezza biologica e aggiungere quattro millilitri di mezzo di crescita a ciascuno.

Richiudere le provette e incubarle a 37 gradi Celsius e 5% CO2 per tre a sette giorni. Una volta che le colture sono pronte per essere analizzate, ispezionare prima il mezzo in modo visivo. Un mezzo torbido indica effetti citopatici indotti da virus o contaminazione con altri microrganismi, o entrambi; esaminare quindi le colture che presentano un mezzo torbido al microscopio ottico invertito.

I virus provocano tipicamente la deformazione delle cellule e il loro distacco dai flaconi di coltura. Se viene rilevata una contaminazione da batteri, lieviti o funghi, oppure se la coltura contiene molti detriti di zanzare, eseguire nuovamente il test sul pool originale di zanzare dopo averlo filtrato attraverso una siringa da 0,22 micron. Filtrare e distribuire asetticamente uno o due millilitri di mezzo di coltura da colture positive al virus e non contaminate da altri microrganismi in provette criogeniche etichettate.

Conservare i campioni contenenti il virus a meno 80 gradi Celsius fino all'identificazione, utilizzando i saggi diagnostici appropriati con questo saggio. Nove diversi tipi di virus appartenenti a quattro famiglie tassonomiche sono stati isolati da zanzare raccolte nel Connecticut durante un periodo continuo di sorveglianza su scala statale dal 1997 al 2010. Diversi di questi virus, tra cui il virus dell'encefalite equina orientale e il virus del Nilo occidentale, sono noti per causare malattie nell'uomo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ordinare, elaborare e analizzare le zanzare per l'infezione virale mediante saggio di coltura cellulare virale.