Le nanoparticelle fluorescenti per la misurazione della concentrazione di ioni in sistemi biologici

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di fabbricare nanosensori di sodio per applicazioni in vitro e in vivo. Ciò si ottiene preparando una miscela di optosensori contenente i componenti del sensore per i nanosensori. Come secondo passaggio, il tensioattivo viene sonicato in soluzione acquosa per distribuirlo uniformemente, il che consentirà la formazione di nanosensori quando viene aggiunto l'opto.

Successivamente, la miscela optografica viene aggiunta alla miscela acquosa di tensioattivo sotto sonicazione per formare i nanosensori in soluzione. Questo video dimostra che la risposta del sensore è regolabile. I sensori possono essere microiniettati nei miociti cardiaci e i sensori possono anche essere iniettati per via sottocutanea nei topi.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i coloranti indicatori fluorescenti, è che possiamo sintonizzare i sensori su una gamma dinamica che corrisponde all'ambiente fisiologico, misurare una gamma più ampia di analiti ed eseguire misurazioni metriche per l'analisi quantitativa. In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché una volta realizzati i sensori, può sembrare scoraggiante introdurli in un ambiente biologico. Le scorte di ione sodio secco quattro x TFPB secco e cromo quattro tre devono essere preparate prima di effettuare l'opto secondo il protocollo scritto.

In una cappa aspirante, unire tutti i materiali in una fiala di vetro da 1,5 millilitri. Con un tappo a vite rivestito in teflon, agitare delicatamente la fiala fino a quando tutto il PVC non si è sciolto. La soluzione dovrebbe apparire in rosso.

Iniziate a realizzare i nanosensori aggiungendo 100 microlitri di 10 milligrammi per millilitro. Versare il lipide in una fiala di vetro da quattro grammi. Quindi, aggiungi quattro millilitri della soluzione acquosa desiderata, come gli hippie da 10 millimolari.

Sincronizzare una punta fornicatrice di sette millimetri nella fiala utilizzando un martinetto da laboratorio e applicare una bassa potenza di sonicazione per 30 secondi. In una provetta da 0,6 millilitri, unire 50 microlitri di optomateriale e 50 microlitri di clorometano utilizzando la pipetta per garantire una miscelazione uniforme. Quindi, inizia una sonicazione di tre minuti.

All'inizio della sonicazione, aggiungere 100 microlitri della miscela optometrica immergendo il puntale della pipetta ed erogando l'intero volume in un'unica iniezione rapida e uniforme. La soluzione diventerà blu se il pH sale sopra i sette e se non c'è sodio per rimuovere il THF residuo e il clorometano dalla soluzione. Spostare la punta sonica a una profondità di due millimetri.

Con lo scorrere dei tre minuti rimanenti, la soluzione diventerà opaca. Una volta completata la sonicazione, estrarre la soluzione Nanosensor in una siringa da cinque millilitri. Collegare un filtro ed erogare la soluzione del nanosensore in una fiala di vetro con tappo a vite.

Iniziare preparando 10 soluzioni con una concentrazione di sodio progressivamente crescente rispetto alla quale è possibile misurare la sensibilità del nanosensore. Combinare le soluzioni madre di sodio zero molare e un molare in provette coniche da 50 millilitri. Ora in una piastra a pozzetti a fondo ottico 96 aggiunge 100 microlitri di ciascuna concentrazione di sodio a tre pozzetti in una colonna.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di nanosensori appena preparati a ciascun pozzetto, caricare la piastra in un fluorimetro per micropiastre e inserire le lunghezze d'onda di eccitazione, emissione e taglio ideali per il cromoforo utilizzato. La scelta delle lunghezze d'onda misurate dipende dall'applicazione. Queste lunghezze d'onda consentono misurazioni dinamiche rapide intracellulari o la riduzione del rumore.

Per ottenere valori alfa, dividere il rapporto tra intensità a 570 nanometri per l'intensità a 670 nanometri o 680 nanometri. Tracciare i valori alfa rispetto al logaritmo della concentrazione di sodio. Impostazione del log della concentrazione di sodio zero su meno uno.

Ora adatta una curva sigmoidale alla risposta e dalla curva, calcola la concentrazione di sodio dove il valore alfa è 0,5. Questo rappresenta la concentrazione di sodio alla quale il sensore risponde in modo ottimale. Utilizzando queste informazioni, regolare il rapporto tra sodio iono quattro x sodio TFPB e cromo-iono quattro tre nell'opto per creare nanosensori con la concentrazione ottimale di sodio.

Ad esempio, le curve di risposta dell'eroe di cinque diversi set di nanosensori che rappresentano diverse formulazioni di opto, che variano solo nella quantità di sodio di quattro 10. Per l'imaging intracellulare, sostituire il terreno cellulare con un terreno trasparente come la soluzione di Tyro e trasferire le cellule in una camera di imaging. Ora riempi una pipetta di vetro tirata con una soluzione nanosensoriale realizzata in cinque milligrammi per millilitro di glucosio in acqua.

Quindi montare la pipetta su un micromanipolatore e collegarla a un sistema di iniezione a pressione controllata. Abbassare la pipetta sulla parte superiore della cellula e nel citoplasma. A volte è necessario picchiettare il supporto del manipolatore per perforare la membrana.

Iniettare alcune centinaia di picolitri di soluzione nanosensor e prelevare rapidamente la pipetta. Anestetizzare un topo nudo CD one con fluoro utilizzando una camera di anestesia. Una volta anestetizzato, posizionare il topo nella camera di imaging disinfettata.

Quindi, riempire una siringa da insulina sterile calibro 31 con 10 microlitri di nanosensori con l'appropriato KD in 10 millimolari. PBS. Assicurati di rimuovere tutte le bolle d'aria usando una pinza. Afferrare una piccola piega di pelle lungo la parte posteriore del topo nel sito di iniezione desiderato mentre si afferra la pelle.

Inserire la siringa nella pelle con lo smusso rivolto verso l'alto e l'ago parallelo alla pelle. Ora tirare indietro lo stantuffo della siringa per assicurarsi che l'ago non sia inserito in un vaso sanguigno. Per ridurre al minimo la pressione posteriore, muovi delicatamente l'ago a destra e a sinistra per creare una tasca all'interno della pelle.

Quindi iniettare i sensori e rimuovere delicatamente la siringa. Applicare delicatamente una pressione sul sito di iniezione e rimuovere la soluzione che potrebbe essere fuoriuscita dal sito di iniezione. In genere, vengono effettuate sei iniezioni equidistanti lungo la schiena.

Se si esegue su topi diversi, cambiare l'ago per ridurre al minimo la malattia, la trasmissione e la contaminazione incrociata. Dopo le iniezioni, acquisire immagini in campo chiaro e fluorescenti utilizzando set di filtri che corrispondano strettamente allo spettro di emissione di eccitazione dei nanosensori. Questo riduce anche al minimo l'autofluorescenza della pelle.

Questi miociti cardiaci neonatali sono stati coltivati su un vetro di copertura e iniettati con nanosensori di sodio. Questa immagine fluorescente è stata scattata a una lunghezza d'onda di eccitazione di 639 nanometri. Questa è un'immagine in campo chiaro delle stesse celle, e questa è una sovrapposizione delle due.

C'è un certo raggruppamento di sensori che si verifica, ma le cellule hanno una morfologia normale. I sensori si sono diffusi in tutto il citosol e non c'è carico nucleare. Questa sovrapposizione di un campo luminoso e di un'immagine fluorescente mostra nove diverse iniezioni sottocutanee di nanosensori di sodio nello spazio sottocutaneo di un topo nudo.

Una volta che Masten ha fabbricato i nanosensori può essere fatto in pochi minuti se eseguito correttamente e applicato a qualsiasi ricerca per misurare l'influenza reversibile dell'analita in tempo reale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come caricare i nanosensori nello spazio intracellulare o sottocutaneo per misurazioni quantitative in un ambiente biologico.