Le nanoparticelle fluorescenti per la misurazione della concentrazione di ioni in sistemi biologici

L'obiettivo generale del seguente esperimento è la fabbricazione di nanosensori per il sodio per applicazioni in vitro e in vivo. Questo viene ottenuto preparando una miscela opto contenente i componenti del sensore per i nanosensori. Come secondo passaggio, il tensioattivo viene sottoposto a sonificazione in soluzione acquosa per garantirne una distribuzione uniforme, condizione che permetterà la formazione dei nanosensori quando verrà aggiunta la miscela opto.

Successivamente, la miscela opto viene aggiunta alla miscela acquosa di tensioattivo sotto sonicazione per formare i nanosensori in soluzione. Questo video dimostra che la risposta del sensore è regolabile. I sensori possono essere microiniettati nei miociti cardiaci e possono anche essere iniettati per via sottocutanea nei topi.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i coloranti indicatori fluorescenti, è che possiamo tarare i sensori su un intervallo dinamico corrispondente all'ambiente fisiologico, misurare un intervallo più ampio di analiti ed effettuare misurazioni raziometriche per l'analisi quantitativa. In generale, le persone nuove a questo metodo possono incontrare difficoltà perché, una volta realizzati i sensori, può sembrare impegnativo introdurli in un ambiente biologico. È necessario preparare in anticipo le scorte di tetrafenilborato di sodio anidro, sodio ion four x e chromo four tre, secondo il protocollo scritto, prima di procedere alla realizzazione dell'opto.

In una cappa chimica, unire tutti i materiali in un vial di vetro da 1,5 millilitri. Con un tappo a vite rivestito in Teflon, vortexare delicatamente il vial fino a quando tutto il PVC si sarà sciolto. La soluzione dovrà apparire rossa.

Iniziare la preparazione dei nanosensori aggiungendo 100 microlitri di una soluzione di lipide Peg al 10 milligrammi per millilitro in un vial di vetro da quattro grammi. Successivamente, aggiungere quattro millilitri della soluzione acquosa desiderata, ad esempio 10 millimolare di hippies.

Sincronizzare una punta fornicante di sette millimetri nel flacone utilizzando un sollevatore da laboratorio e applicare una bassa potenza di sonificazione per 30 secondi. In un tubo da 0,6 millilitri, combinare 50 microlitri del materiale opto e 50 microlitri di diclorometano utilizzando la pipetta per garantire un mescolamento omogeneo. Successivamente, avviare una sonificazione di tre minuti.

All'inizio della sonica, aggiungere 100 microlitri della miscela opto immergendo la punta della pipetta ed erogando l'intero volume con un'unica iniezione rapida e uniforme. La soluzione diventerà blu se il pH sale al di sopra di sette, e se non è presente sodio per rimuovere il THF residuo e il diclorometano dalla soluzione. Posizionare la punta del sonicator ad una profondità di due millimetri.

Mentre trascorrono i rimanenti tre minuti, la soluzione diventerà opaca. Al termine della sonificazione, aspirare la soluzione di nanosensori in una siringa da cinque millilitri. Applicare un filtro ed erogare la soluzione di nanosensori in un vial di vetro con tappo a vite.

Iniziare preparando 10 soluzioni con concentrazioni crescenti di sodio, rispetto alle quali può essere misurata la sensibilità del nanosensore. Combinare soluzioni stock di sodio a zero molare e a un molare in provette coniche da 50 millilitri. Successivamente, in una piastra ottica a 96 pozzetti, aggiungere 100 microlitri di ciascuna concentrazione di sodio a tre pozzetti per colonna.

Quindi aggiungere 100 microlitri di nanosensori appena preparati in ogni pozzetto, caricare la piastra in un fluorimetro per micropiastre e impostare le lunghezze d'onda di eccitazione, emissione e di taglio ottimali per il cromoforo utilizzato. La scelta delle lunghezze d'onda misurate dipende dall'applicazione. Queste lunghezze d'onda consentono misurazioni intracellulari di dinamiche rapide o una riduzione del rumore.

Per ottenere i valori di alfa, dividere il rapporto tra l'intensità a 570 nanometri e l'intensità a 670 nanometri o a 680 nanometri. Riportare i valori di alfa in funzione del logaritmo della concentrazione di sodio, impostando il logaritmo della concentrazione zero di sodio a meno uno.

Ora adattare una curva sigmoidea alla risposta e, a partire dalla curva, calcolare la concentrazione di sodio in corrispondenza della quale il valore di alfa è 0,5. Questo rappresenta la concentrazione di sodio alla quale il sensore risponde in modo ottimale. Utilizzando queste informazioni, regolare il rapporto tra ione sodio quattro x sodio TFPB e cromo ione quattro tre nell'opto per creare nanosensori con la concentrazione ottimale di sodio.

Ad esempio, curve di risposta di riferimento di cinque diversi set di nanosensori rappresentanti formulazioni ottiche diverse, variabili unicamente nella quantità di sodio di quattro 10. Per l'immagine intracellulare, sostituire il mezzo cellulare con un mezzo limpido come la soluzione di Tyro e trasferire le cellule in una camera per imaging. Riempire ora retrogradamente una pipetta di vetro tirata con soluzione di nanosensore preparata in cinque milligrammi per millilitro di glucosio in acqua.

Quindi montare la pipetta su un micromanipolatore e collegarla a un sistema di iniezione controllato dalla pressione. Abbassare la pipetta sopra la cellula e all'interno del citoplasma. A volte è necessario dare dei colpetti al supporto del manipolatore per perforare la membrana.

Iniettare alcune centinaia di picolitri di soluzione del nanosensore e ritirare rapidamente la pipetta. Anestetizzare un topo CD1 nude con isoflurano utilizzando una camera per anestesia. Una volta anestetizzato, posizionare il topo nella camera per imaging sterilizzata.

Successivamente, riempire una siringa sterile per insulina da 31 gauge con 10 microlitri di nanosensori con il KD appropriato in 10 millimolare di PBS. Assicurarsi di rimuovere tutte le bolle d'aria utilizzando pinzette. Afferrare una piccola piega di pelle lungo la schiena del topo nel sito di iniezione desiderato mentre si tiene la pelle.

Inserire la siringa nella pelle con il bisellino rivolto verso l'alto e l'ago parallelo alla superficie cutanea. Ora tirare indietro lo stantuffo della siringa per accertarsi che l'ago non sia penetrato in un vaso sanguigno. Per ridurre la pressione retrostante, muovere delicatamente l'ago a destra e a sinistra per creare una tasca all'interno della pelle.

Quindi iniettare i sensori ed estrarre delicatamente la siringa. Applicare una leggera pressione sul sito di iniezione e rimuovere con una pulizia qualsiasi soluzione fuoriuscita dal sito. Tipicamente, si eseguono sei iniezioni distribuite uniformemente lungo la schiena.

Se si interviene su topi diversi, cambiare l'ago per ridurre al minimo la trasmissione di malattie e la cross-contaminazione. Dopo le iniezioni, acquisire immagini in campo chiaro e in fluorescenza utilizzando set di filtri che corrispondano il più possibile allo spettro di emissione di eccitazione dei nanosensori. Questo riduce anche l'autofluorescenza della pelle.

Questi miociti cardiaci neonatali sono stati coltivati su un vetrino e iniettati con nanosensori di sodio. Questa immagine fluorescente è stata acquisita con una lunghezza d'onda di eccitazione di 639 nanometri. Questa è un'immagine in campo chiaro delle stesse cellule, e questa è una sovrapposizione delle due immagini.

Si verifica un certo raggruppamento dei sensori, ma le cellule presentano una morfologia normale. I sensori si sono diffusi in tutto il citosol e non c'è accumulo nel nucleo. Questa sovrapposizione di un'immagine in campo chiaro e di un'immagine fluorescente mostra nove iniezioni sottocutanee diverse di nano-sensori di sodio nello spazio sottocutaneo di un topo nudo.

Una volta che la fabbricazione di nanosensori Masten può essere completata in pochi minuti se eseguita correttamente e applicata a qualsiasi ricerca per misurare in tempo reale il flusso reversibile di analiti. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come caricare i nanosensori nello spazio intracellulare o sottocutaneo per effettuare misurazioni quantitative in un ambiente biologico.