Low-Cost Cryo-Stage Light fabbricazione microscopia per Luce correlate / Microscopia Elettronica
5 giugno 2011
Dimostriamo la realizzazione di un basso costo stadio criogenico progettato per adattarsi microscopi a luce riflessa più. Questo laboratorio costruito fase criogenica consente efficiente e affidabile di imaging correlativa tra crio-crio-luce e microscopia elettronica.
Ciao, sono David Carlson, studente laureato nel laboratorio di James Evans in Biochimica e Biologia Molecolare presso l'Università della California di Davis. In questo video, vi mostrerò come costruire una semplice ed efficace piattaforma criogenica per microscopia ottica criogenica correlativa con microscopia elettronica criogenica. Una piattaforma criogenica è composta da un canale di osservazione trasparente, un'apertura per le lenti obiettivo, un contenitore per azoto liquido, un dissipatore di calore per l'osservazione del campione e un supporto per il trasferimento del campione.
La maggior parte dei materiali utilizzati è stata acquistata in un negozio di ferramenta e in un negozio di alimentari. I materiali comprendono una teglia per torta da nove pollici, una tortiera da nove pollici, quattro paia di bastoncini per mangiare, schiuma espansa spray per riempimento, un blocco di alluminio di quattro centimetri per otto centimetri per un centimetro con fori filettati per viti numero 10 da cinque pollici, viti a testa piatta con intaglio numero dieci da tre quarti di pollice e relativi dadi, tre viti a testa tonda con intaglio numero 4 da 3/8 di pollice e relativi dadi, 15 rondelle numero 10, due blocchi appunti trasparenti in plastica, acqua e un supporto per griglie per microscopia elettronica criogenica e un’asta di manipolazione, disponibili presso Ted Pella.
Posizionare la teglia per torta sul portapreparati del microscopio sotto le lenti obiettivo. Posizionare il blocco di alluminio vicino al bordo della teglia e mettere a fuoco la superficie dell'alluminio. Verificare che le lenti obiettivo possano ruotare liberamente all'interno e all'esterno rispetto al bordo della teglia.
Se così non fosse, riposizionare il blocco di alluminio e verificare nuovamente. Una volta determinata la posizione del blocco di alluminio, segnare con un pennarello la posizione dei bulloni di fissaggio. Posizionare la scatola della griglia criogenica accanto al blocco di alluminio e, con un pennarello, registrare la posizione della tacca e di ciascun lato della scatola della griglia criogenica, riportando sul fondo della pirofila il disegno dei bulloni.
Utilizzare una punta affilata e un martello per praticare fori di partenza su ciascuno dei punti segnati, usando una punta da trapano numero 17. Praticare i fori per il montaggio del blocco di alluminio. Arrotondare ogni foro per levigare i bordi.
Successivamente, utilizzare una punta da trapano numero 35 per forare e arrotondare i fori per il montaggio della scatola per griglie criogeniche, il piatto piano. Preparazione e foratura completate. Inserire dei bulloni testa piana a fessura numero dieci da tre quarti di pollice nei fori del blocco di alluminio e posizionare due rondelle SAE numero 10 su ciascun lato del blocco di alluminio.
Fori di fissaggio sul piatto per torta. Successivamente, montare il blocco utilizzando le dita per avvitare ciascun bullone e stringerli con un trapano. Capovolgere il piatto per torta e posizionare una rondella numero 10 su ciascun bullone, fissandole con un dado.
Utilizzare una chiave inglese per assicurarsi che tutti i dadi siano ben serrati. Successivamente, dal retro della pirofila, inserire il numero quattro, testa tonda con fessura. Avvitare i bulloni attraverso i fori di montaggio del supporto per griglie criogeniche e fissarli con un dado dalla parte superiore della pirofila.
Una volta completata la parte superiore della fase criogenica, mostriamo come trasferire la scatola della griglia criogenica in assenza sia della cartelletta di plastica sia dell'azoto liquido. Successivamente, iniziamo la preparazione del modello in schiuma isolante. Iniziare fissando con del nastro gli stuzzicadenti a mazzetti di due.
Quindi fissare con del nastro adesivo ciascun fascio di bacchette sul bordo della teglia per torte, posizionandole una di fronte all'altra. Lo scopo delle bacchette è garantire uno spessore uniforme dell'isolante in schiuma. Successivamente, inumidire con acqua la teglia per torte e la superficie inferiore della pirofila.
Iniziare aggiungendo uno strato singolo di ottimo materiale. Spruzzare schiuma su tutta la base della teglia e nebulizzare con acqua. Aggiungere un secondo strato di ottimo materiale riempito con schiuma espansa e nebulizzare con acqua.
Premere in modo uniforme e deciso la teglia per crostata all'interno della teglia per torte. Capovolgere le due teglie unite e apporre un peso pesante sulla parte superiore. Lasciare polimerizzare la schiuma per tutta la notte.
Una volta che la schiuma è indurita, utilizzare un coltello a lama seghettata per staccare la pirofila e rimuovere l'eccesso di schiuma dai lati della pirofila stessa. Rimuovere gli spessori di bastoncini da sushi e separare la pirofila da forno dalla teglia per torte. La schiuma dovrebbe rimanere aderente alla pirofila.
Successivamente, posizionare la fase criogenica sotto l'obiettivo e appoggiare una cartelletta di plastica sopra di essa. Con un pennarello, tracciare il percorso degli obiettivi mentre ruotano all'interno e all'esterno. Segnare una X lontano dalla semicirconferenza, vicino al bordo della piroetta.
Con la seconda tavoletta, segnare la posizione del supporto del box della griglia per la folla. Ritagliare il foro per il box della griglia per la folla utilizzando una punta da trapano da tre quarti di pollice e un trapano, premendo sull'altra tavoletta. Ritagliare la X con una punta da trapano da tre quarti di pollice.
Rimuovere la zona semicircolare effettuando diversi tagli con un trapano a colonna e un fresa ad anello da tre pollici. Ora la fabbricazione è completa. I materiali necessari per la preparazione del campione includono una scatola per griglie criogeniche e pinzette con asta di manipolazione, un blocco di trasferimento per scatola di griglie criogeniche, uno strofinaccio in tessuto non tessuto, una coppa di raffreddamento e una coppa di etano liquido, griglie EM in carbonio R214 con maglia 400, una scatola in polistirolo e un congelatore pneumatico a immersione. Riempire verticalmente la scatola in polistirolo, la scatola per griglie criogeniche, il blocco di trasferimento, la coppa di raffreddamento e la coppa di etano liquido con azoto liquido.
Successivamente, posizionare la scatola della griglia criogenica nel blocco di trasferimento della scatola della griglia criogenica. Utilizzare le pinzette per tenere la griglia EM con il lato al carbonio rivolto verso l'alto. Applicare due microlitri di sospensione cellulare a due volte 10 alla sei cellule per millilitro sulla parte superiore della griglia.
Caricare le pinzette sullo stantuffo pneumatico e aspirare il liquido dalla superficie della griglia tenendo un pezzo di tessuto chimico strappato sul retro della griglia per microscopia elettronica ed immergendola nella sospensione di etano liquido. Spostare rapidamente la griglia dall'etano liquido all'azoto liquido e posizionarla in una scatola criogenica per griglie. Per utilizzare lo stadio criogenico, iniziare riempiendo il contenitore con azoto liquido e coprendolo con una cartelletta.
Dopo aver trasferito la scatola della griglia criogenica attraverso l'intero taglio nel raccoglitore di plastica, rimuovere una griglia dalla scatola e posizionarla sulla superficie di osservazione del blocco di alluminio. Dopo aver spostato lo stadio criogenico nella posizione corretta sul microscopio, posizionare il secondo raccoglitore sopra il primo con attenzione. Far scivolare fuori il primo raccoglitore.
Inserire le lenti obiettivo e utilizzare il microscopio normalmente. Iniziare esaminando con ingrandimento basso il centro della griglia indicato da tre linguette metalliche. In questo punto, mettere a fuoco a 50 x.
È possibile osservare uno strato sottile di ghiaccio vetroso che ricopre la griglia e che cambia fluorescenza. Si può vedere il marcatore istonico CFP localizzato nel nucleo della cellula. Successivamente passo all'obiettivo 100 x e metto a fuoco singole cellule di lievito.
Per rimuovere lo stadio criogenico dal microscopio, posizionare la prima cartelletta sopra la seconda e far scivolare con attenzione la cartelletta inferiore all'esterno. Rimuovere lo stadio criogenico dal microscopio e reinserire la griglia nella scatola per griglie criogeniche utilizzando l'incisione presente sulla cartelletta. Infine, avvitare l'asta di manipolazione della scatola per griglie criogeniche sulla scatola stessa e trasferirla in azoto liquido per essere osservata in un momento successivo.
Per la microscopia elettronica, la stabilità del portacampioni è molto importante. Nella microscopia, abbiamo riscontrato che la maggior parte dell'instabilità dell'immagine nel nostro sistema deriva dal peso aggiuntivo del portacampioni criogenico sullo stage del microscopio. In assenza di azoto liquido, si può osservare un elevato grado di instabilità quando si è a fuoco sul blocco di alluminio.
Aggiungendo un supporto alla parte anteriore della piastra del microscopio, l'instabilità viene notevolmente ridotta. Qui mostro una struttura di supporto composta da un meccanismo a vite regolabile che posiziono tra la piastra e la base del microscopio. Il vantaggio del supporto aggiuntivo è evidente anche nella microscopia criogenica, che dimostra come l'instabilità derivi dal peso aggiuntivo e non dalle bolle di azoto liquido.
Come puoi vedere, questo stadio criogenico per microscopia ottica è un metodo economico e utile per raccogliere informazioni fluorescenti su cellule congelate in stato idratato. La scansione in campo chiaro e in campo scuro permette di mappare le aree con ghiaccio uniforme. Una volta localizzate queste aree di interesse, possiamo utilizzare il canale di fluorescenza per visualizzare il nostro fluorocromo, impiegato per marcare le proteine di interesse, in questo caso un marcatore di istone CFP.
Dopo aver acquisito le immagini in fluorescenza criogenica, possiamo utilizzare le immagini a basso ingrandimento per mappare e individuare la stessa griglia, lo stesso quadrato e acquisire le stesse cellule in microscopia elettronica criogenica. Come si può vedere, questo sistema criogenico per microscopia ottica rappresenta un metodo utile ed economico per ottenere immagini fluorescenti di campioni di idrogeno congelati. La stessa regione può inoltre essere osservata in criomicroscopia elettronica seguendo le tecniche standard di trasferimento e acquisizione in criomicroscopia elettronica.
In questo caso, i dati di microscopia ottica criogenica fungono da mappa di riferimento per identificare la regione esatta per lo studio correlative. Questa fase può essere applicata all’imaging correlative di molti tipi di campioni, inclusi cellule intere, reazioni in vitro di complessi macromolecolari o organelli isolati e sezioni criogeniche sottili di tessuto. Grazie per averci guardato e spero che troviate questa fase di microscopia ottica criogenica utile quanto noi.
Panoramica
In questo articolo viene illustrata la realizzazione di una piattaforma criogenica economica, adatta alla maggior parte dei microscopi a luce riflessa. La piattaforma criogenica costruita in laboratorio consente un'immagine correlativa efficiente e affidabile tra microscopia criogenica a luce e microscopia criogenica a electroni.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Tecniche di microscopia
Sfondo
- Le fasi criogeniche sono essenziali per l'analisi di campioni biologici a basse temperature.
- L'imaging correlative combina diverse tecniche di microscopia per un'analisi migliorata.
- Soluzioni a basso costo sono fondamentali per garantire accessibilità nei laboratori di ricerca.
- Questo studio si concentra su un approccio fai-da-te per la costruzione di una fase criogenica.
Scopo dello studio
- Fornire un metodo economico per la costruzione di una fase criogenica.
- Permettere ai ricercatori di eseguire efficacemente immagini correlate.
- Dimostrare l'uso di materiali facilmente reperibili per la costruzione della fase.
Metodi Utilizzati
- Costruzione di una fase criogenica utilizzando materiali comuni.
- Assemblaggio dei componenti, inclusi un flusso di osservazione e un erogatore di azoto liquido.
- Preparazione dei campioni per la microscopia elettronica criogenica.
- Dimostrazione della procedura operativa per la fase criogenica.
Risultati principali
- La fase criogenica è stata costruita e testata con successo.
- È stato dimostrato un trasferimento efficiente dei campioni utilizzando la fase.
- È stata ottenuta un'immagine correlativa tra microscopia criogenica a luce ed elettronica criogenica.
- Il design si è rivelato funzionale e affidabile ai fini dell'acquisizione di immagini.
Conclusioni
- La piastra criogenica fai-da-te è un'opzione praticabile per i ricercatori.
- Questo approccio aumenta l'accessibilità a tecniche avanzate di imaging.
- Un'ulteriore ottimizzazione e verifica potrebbe migliorare il progetto.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La microscopia correlativa criogenica a luce e a elettroni consente l'acquisizione diretta di immagini di campioni idratati congelati, fornendo informazioni meccanicistiche sulle dinamiche cellulari e sull'ultrastruttura in uno stato prossimo a quello nativo. La fase criogenica a basso costo descritta in questo protocollo riduce le barriere economiche e tecniche, permettendo un accesso più ampio all'imaging correlativo per la validazione di bersagli e lo screening fenotipico nelle fasi iniziali della scoperta. Questo approccio aumenta l'affidabilità predittiva consentendo la correlazione diretta della localizzazione della fluorescenza con dati strutturali ad alta risoluzione ottenuti dallo stesso campione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche correlando la localizzazione proteica (ad esempio, marcatore di istone CFP) con l'ultrastruttura subcellulare in cellule vitrificate.
- Valore operativo: Utilizza griglie criogeniche da 3 mm rivestite in carbonio come supporti per i campioni, integrandosi con i protocolli consolidati di vitrificazione e manipolazione delle griglie.
- Valore predittivo: Favorisce la riduzione dei rischi legati al bersaglio fornendo dati complementari di fluorescenza e densità elettronica dalla stessa regione di interesse.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati per l'analisi successiva mediante microscopia crioelettronica, garantendo l'integrità del campione attraverso un'immobilizzazione fisica rapida.
- Valore operativo: Permette la standardizzazione dei saggi mediante una vitrificazione e un trasferimento della griglia riproducibili, utilizzando materiali economici reperibili nei negozi di bricolage.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma su diversi sistemi modello (ad esempio cellule di lievito, organelli, sezioni di tessuto) per ottenere immagini correlate coerenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega l'imaging della scoperta alla validazione preclinica permettendo la correlazione diretta di dati di microscopia ottica ed elettronica ottenuti dagli stessi campioni.
- De-risking meccanicistico: Riduce l'ambiguità negli studi di interazione con il bersaglio evitando l'analisi comparativa di "campioni rappresentativi" e invece effettuando l'imaging della medesima cellula.
- Sistema rilevante per le malattie: Applicabile a diversi tipi di campioni, inclusi cellule intere, complessi macromolecolari, organelli e sezioni crio-microtomizzate di tessuto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La fase di microscopia a criotemperatura si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica delle ipotesi all'identificazione dei composti promettenti fino alla valutazione preclinica, consentendo un affinamento iterativo dei modelli biologici sulla base di dati strutturali e funzionali correlati.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo la visualizzazione di proteine marcate con fluorofori (ad esempio, istone CFP nucleare) in cellule di lievito idratate e congelate a 50x e 100x di ingrandimento.
- Screening: Fornisce letture quantitative della fluorescenza e mappe dell'uniformità del ghiaccio in campo chiaro/campo scuro per identificare le regioni di interesse destinate a successive analisi con microscopia crioelettronica (cryo-EM).
- Analisi: Permette il confronto affiancato di dati ottenuti con cryo-LM e cryo-EM dalla stessa area della griglia, facilitando l'integrazione dei dati e la validazione degli obiettivi.
- Ricerca traslazionale: Collega le immagini della fase iniziale della scoperta ai flussi di lavoro preclinici preservando la vetrificazione del campione e consentendo un trasferimento senza interruzioni alla cryo-EM.
- Riutilizzo aziendale: Progettato per un uso ripetuto con griglie standard per cryo-EM e comuni microscopi a luce riflessa, promuovendo la standardizzazione tra progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce un'attendibilità predittiva attraverso l'immagine correlativa diretta, riducendo l'ambiguità meccanicistica negli studi di validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e standardizzazione mediante una fabbricazione semplice che utilizza materiali facilmente reperibili (teglia per tubi, teglia per torte, blocco di alluminio, bulloni, schiuma spray).
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto consentendo una riduzione precoce dei rischi associati agli obiettivi, grazie a dati multimodali ottenuti da campioni identici.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sulla gestione del rischio generando set di dati complementari che migliorano la caratterizzazione degli obiettivi prima dell'ottimizzazione del capostipite.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede una formazione di base in microscopia e familiarità con le procedure di manipolazione delle griglie per criomicroscopia elettronica e di vitrificazione.
- Necessita di un microscopio a luce riflessa dotato di obiettivi a secco con lunga distanza di lavoro e accesso all'azoto liquido e all'etano per la congelazione rapida.
- Richiede la standardizzazione della preparazione delle griglie, dell'applicazione del campione (2 µL di 2×10⁶ cellule/mL) e della gestione della tamponatura e delle pinzette per ottenere risultati costanti.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi sistemi modello (ad esempio, regolando la concentrazione del campione o il tempo di tamponatura per organelli rispetto a cellule intere).
- Include limitazioni pratiche, come l'instabilità del microscopio indotta dallo stadio, ridotta aggiungendo un supporto meccanico tra lo stadio e la base.
