Name: Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine e piccole molecole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 15 s
Description: Scopri come fabbricare biosensori elettrochimici-DNA per rilevare acidi nucleici, proteine e piccole molecole in matrici biologiche complesse come sangue e siero. Questo metodo versatile supporta la diagnostica molecolare.

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Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione (OPP1015402) dalla Bill and Melinda Gates Foundation attraverso il Grand Challenges Explorations iniziativa, e dal NIH tramite sovvenzioni GM062958-01 e 2R01EB002046. Questo lavoro è stato svolto in parte sotto l&#39;egida del Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti da Lawrence Livermore National Laboratory nell&#39;ambito del contratto DE-AC52-07NA27344.

1. Impostazione della fase <ol><li> Acquisto pertinenti, il DNA sonda modificati chimicamente da una società di sintesi su oligonucleotidi come Technologies Biosearch (Novato, CA) o Midland Certified (Midland, TX). La sonda viene modificato durante la sintesi con l'aggiunta di un tiolo C6 alla sua 3'-end e un redox-attivi blu di metilene al suo 5'-end. </li><li> Sciogliere il DNA sonda in soluzione salina tampone fosfato pH 7,4 a una concentrazione di 200 micron e verificare la sua concentrazione misurando la sua assorbanza a 260 nm con uno spettrofotometro. A causa della porzione blu di metilene sulla sonda DNA la soluzione deve avere una tinta blu visibile. </li><li> Appena preparare 1 ml di una soluzione 10 mM di tris (2-carbossietil) fosfina TCEP in distillata, acqua deionizzata (acqua demineralizzata). Nella nostra esperienza, queste soluzioni TCEP rimangono freschi per una settimana, se conservato al buio a 4 ° C. </li><li> Per ridurre i ponti disolfuro che potrebbero essere presenti nella soluzione del DNA sonda, unire 1 ml di soluzione madre sonda di DNA con 2 ml di soluzione TCEP e mescolare delicatamente con una pipetta. Incubare la miscela per un'ora al buio, contenitore refrigerato. La soluzione inizialmente blu dovrebbe diventare chiaro come il TCEP riduce reversibilmente il blu di metilene. Se la soluzione non diventa chiaro, ripetere la procedura utilizzando una soluzione fresca TCEP o, eventualmente, a temperatura ambiente. </li><li> Dopo un'ora diluire la soluzione ridotto sonda di DNA con 1 ml di tampone, questo lo diluire ad una concentrazione di 200Nm. In seguito, si incubare una serie di elettrodi disco d'oro in 200 ml di porzioni questa soluzione diluita sonda. </li><li> Appena preparare almeno 2 ml di 2mM mercaptohexanol in tampone fosfato salino. </li></ol> 2. Sensore di preparazione <ol><li> Combina 0,05 micron polvere di allumina con acqua su un panno fine. Lucidare una serie di elettrodi disco d'oro (CH Instruments, Austin, TX) premendo la superficie d'oro saldamente il panno bagnato, e lo spostamento in una figura otto modello per circa tre minuti per ogni elettrodo. </li><li> Lavare gli elettrodi lucido con acqua demineralizzata e immergerli in provette Eppendorf riempito con la stessa. Ultrasuoni per cinque minuti per rimuovere ogni residuo di polvere di allumina. </li><li> Posizionare gli elettrodi in una soluzione 0,5 M di acido solforico, allegarle a un potenziostato insieme a un contatore di platino e argento / argento cloruro di elettrodo di riferimento, ed eseguire una serie di voltammograms di ossidare, ridurre e elettrochimicamente pulite le superfici. A seguito di questa eseguire una seconda pulizia elettrochimica in una soluzione di KCl 0,01 M a 0,1 M di acido solforico. I dettagli di queste operazioni di pulizia si possono trovare in Nature nostro protocolli 1, e nel supplemento di questo video. </li><li> Organizzare una serie di 2 ml provette Eppendorf in un rack e riempire ogni con 200 microlitri della soluzione di DNA sonda. La concentrazione del DNA sonda in questa soluzione definirà la densità con la quale la sonda DNA pacchetto sulla superficie del sensore. Prestazioni del sensore è fortemente dipendente dalla densità della sonda, con la densità ottimale che variano da un sensore di architettura a quella successiva. La concentrazione sonda utilizzata in questa fase devono quindi essere ottimizzate per ogni nuovo tipo di sensore 2. Per le architetture sonda abbiamo studiato fino ad oggi, le concentrazioni sonda di DNA che impieghiamo in questa fascia di passo da 15 nm a 2 micron, con 200 nM di essere un valore tipico. </li><li> Lavare gli elettrodi disco d'oro con acqua demineralizzata, e poi immergere nella soluzione di rilevanti DNA sonda in una provetta Eppendorf per un'ora. A questo punto, il DNA sonda attribuirà alla superficie dell'elettrodo d'oro attraverso la formazione di un tiolo-on-oro monostrato auto assemblate. </li><li> Lavare gli elettrodi con acqua demineralizzata, immergerle in 2mM mercaptohexanol in una provetta Eppendorf e conservarle in un luogo buio per 3 ore a notte a temperatura ambiente per garantire la formazione completa della monostrato auto assemblate. Questa fase comprende la mercaptohexanol come parte di un monostrato misto a garantire la formazione di un monostrato stabile. Per evitare l'evaporazione si consiglia di sigillare l'elettrodo all'interno del tubo Eppendorf con parafilm. I sensori possono essere memorizzati in questa soluzione per diversi giorni, se necessario. </li><li> Quando si è pronti per utilizzare il sensore, sciacquare con acqua demineralizzata e poi immergerlo in un tampone per almeno dieci minuti. Sensori volti a rilevazione degli anticorpi devono essere immersi in una soluzione di 100 nM del filamento riconoscimento rilevanti prima dell'uso, seguito da un risciacquo estremamente veloce con il tampone. </li></ol> 3. Sensore di test, rilevamento del DNA <ol><li> In questo protocollo, da 17 filamento sonda nucleotide è apposto su un elettrodo d'oro. Ha un giornalista redox blu di metilene al suo 3'-end (Figura 1). Quando la molecola sonda ibrida con un filo di cattura, la corrente attraverso il circuito del sensore diminuisce. </li><li> Sciacquare un sensore di fresco con acqua demineralizzata ed immergerlo in un vuotocampione manca il bersaglio in modo da registrare il segnale di fondo che produce. Collegare il sensore al cavo elettrodo di lavoro di un potenziostato. Posizionare un elettrodo contatore platino e un argento / argento cloruro di elettrodo di riferimento nella soluzione. </li><li> Eseguire una misurazione ad onda quadra da 0 a -0,6 V con un'ampiezza di 25 mV e un passo di 1mV. La frequenza ottimale onda quadra dipenderà dai dettagli dell'architettura sonda 2,3; per le architetture sonda abbiamo impiegato i valori ottimali sono tipicamente nella gamma da 60 a 600 Hz.. Si dovrebbe vedere un picco arrotondato a circa -0,35 V, il potenziale redox del blu di metilene (il potenziale di picco potrebbe spostarsi leggermente a seconda del pH della soluzione esatta di prova). L'altezza dal basale a questa corrente di picco è proporzionale alla efficienza di trasferimento di elettroni tra il blu di metilene e l'elettrodo di oro (Figura 2). Salva questo misurazione del fondo. </li><li> Spostare gli elettrodi di una soluzione che contiene la molecola di DNA bersaglio di interesse, equilibrare (5 a 120 min a seconda della struttura le dimensioni e la concentrazione del target4, 5) e raccogliere un voltammagram secondo un'onda quadra. L'altezza del picco a -0,35 V cambierà da iniziale, misurazione del fondo. L'entità di questo cambiamento è legato alla concentrazione dell'analita. Si tratta di dati di output principale di questo sensore (Figura 3). </li><li> Misurare il cambiamento relativo segnale, la diminuzione percentuale o aumento del segnale relativo al picco di fondo, spesso è più riproducibile di misurare la variazione assoluta di corrente, in quanto corregge le variazioni di superficie dell'elettrodo. Per fare questo, la differenza tra la corrente di picco e la corrente di picco di fondo sono divisi per il picco di sfondo corrente. </li></ol> 4. Sensore di Rigenerazione <ol><li> Una volta che le misurazioni sono state completate, spostare il sensore in un contenitore riempito con acqua demineralizzata per 30 s, oppure spruzzare con un flusso costante di acqua demineralizzata per 30 s. Ripetere questa altre due volte con dolce acqua deionizzata. Nota: alcuni analiti sono resistenti a questo approccio, per loro provare aggressivi risciacquo in 6 M guanidina cloridrato o etanolo al 70%. </li><li> Mettere il sensore posteriore in una soluzione in cui le misure saranno effettuate. Nel giro di un minuto, l'altezza del picco dovrebbe essere restituita al suo valore originale. Vale la pena notare che questi sensori spesso mostrano un cambiamento di segnale leggermente più grande durante il loro primo test e ciclo di rigenerazione, ed i risultati altamente coerente durante i cicli successivi 6. </li></ol> 5. Sensore di test, ricerca di anticorpi <ol><li> In questo protocollo, la sonda di DNA di blu di metilene e tiolo modificati utilizzati in questi sensori funge da filo "ancora" 7. E 'collegato direttamente all'elettrodo d'oro. Questo è quindi ibridato con un secondo filone "riconoscimento" del DNA che è stato coniugato covalentemente per l'antigene in questione (Figura 4). Abbiamo avuto fortuna con le case sintesi commerciali, come le tecnologie Biosearch e Panagene, per la sintesi del DNA-antigene necessaria chimere. L'ibridazione avviene con il trasferimento di un sensore di prefabbricati in una provetta Eppendorf contenente 100 nM del filamento di DNA rilevante riconoscimento in PBS per 1 ora. </li><li> Posizionare il sensore nella soluzione di rilevanti vuoto. Allegarlo al piombo dell'elettrodo di lavoro di un potenziostato e posizionare un elettrodo contatore platino e argento / elettrodo di riferimento nella soluzione di cloruro. </li><li> Eseguire voltammetria ad onda quadra come descritto sopra. Per l'architettura sonda particolare abbiamo impiegato qui l'ottimale frequenza dell'onda quadra è di 60 Hz. Si dovrebbe vedere un picco arrotondato intorno -0,35 V. Salva questo misurazione del fondo. </li><li> Trasferire gli elettrodi di una soluzione contenente l'analita target, incubare per 5 a 60 minuti, e raccogliere un voltammagram secondo un'onda quadra. Se il bersaglio degli anticorpi è presente il picco a -0,35 V diminuirà. L'entità di questo cambiamento è legato alla concentrazione di anticorpi. </li></ol> 6. Sensore di prova, Molecule Detection Piccoli <ol><li> In questo caso, la molecola sonda sulla superficie del sensore è un aptamero, una molecola di DNA o RNA che è stato selezionato in vitro per associare un analita molecolare specifico, che cambia la sua struttura (pieghe) su vincolante per i suoi dell'analita bersaglio 8,9 ( Figura 5). Qui ci impiegano un cocaina-vincolante, aptamero DNA sviluppato dal Stojanovic 10,11 laboratorio. </li><li> Sciacquare un sensore di fresco con acqua demineralizzata e immergerlo in un campione in bianco manca il bersaglio in modo da registrare il segnale di fondo che produce. Collegare il sensore al cavo elettrodo di lavoro di un potenziostato. Mettere un contatore di platino e un argento / argento cloruro di riferimento nella soluzione. </li><li> Eseguire voltammetria ad onda quadra come descritto sopra. Per l'architettura sonda particolare abbiamo impiegato qui la frequenza ottimale onda quadra è 200Hz (Ma funziona anche 60 Hz). Si dovrebbe vedere un picco arrotondato intorno -0,35 V. Salva questo misurazione del fondo. </li><li> Trasferire gli elettrodi di una soluzione contenente l'analita target, incubare per ~ 5 minuti, e raccogliere un voltammagram secondo un'onda quadra. L'altezza del picco a -0,35 V cambierà. L'entità di questo cambiamento è legato alla concentrazione dell'analita bersaglio. Se non è possibile ottenere un campione di cocaina, procaina, il cui uso è regolamentato, può essere utilizzato come un sostituto. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Quando viene utilizzato per rilevare il DNA utilizzando la prima architettura, il segnale dovrebbe diminuire di almeno il 60% quando equilibrata bersaglio a 200 nM. Dopo tre brevi risciacqui in acqua deionizzata, il segnale dovrebbe tornare molto vicino (entro 0,1-5%) al suo valore originale. Sensori di rilevamento degli anticorpi devono essere sottoposti ad una diminuzione del segnale dal 40 al 80%. Aptamer a base di sensori per il rilevamento di cocaina mostrano un aumento del segnale fino a 200% a seconda della copertura di frequenza e la superficie in cui operano. Per il sensore di cocaina, una copertura superficiale bassa è meglio 3. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Rilevazione del DNA con un biosensore elettrochimico DNA. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Schermata che mostra il segnale prodotto da un E-DNA biosensore durante voltammetria ad onda quadra. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Schermata che mostra i segnali prodotti da una E-DNA biosensore durante voltammetria ad onda quadra, prima e dopo ibridazione con un analita. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Individuazione di anticorpi con un biosensore patibolo. <img src="/files/ftp_upload/2922/2922fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Rilevamento di cocaina o procaina con un biosensore elettrochimico aptamero. <table border="1"><tbody><tr><td> Personalizzati Oligo </td><td> Sequenza </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Lineare sonda DNA (LP17) </td><td> 5'-HS-(CH2) 6-TGGATCGGCGTTTTATT-(CH2) 7-NH-MB-3 ' </td><td> HPLC purificato, può essere ordinato con la SS </td></tr><tr><td> Analita bersaglio del DNA </td><td> AATAAAACGCCGATCCA </td><td> Non modificato </td></tr><tr><td> Riconoscimento Strand </td><td> 5'-antigene-TEG-CAGTGGCGTTTTATTCTTGTTACTG-3 ' </td><td></td></tr><tr><td> Ponteggio di ancoraggio </td><td> 5'-HS-(CH 2) 6-GCAGTAACAAGAATAAAACGC CACTGC-(CH 2) 7 MB </td><td> HPLC purificato, può essere ordinato con la SS </td></tr><tr><td> A4 cocaina aptamero </td><td> 5'-HS-AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG-MethyleneBlue-3 ' </td><td> HPLC purificato, può essere ordinato con la SS </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Sonda e sequenze di DNA bersaglio.

<ol><li>Xiao, Y., Lai, R. Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+electrode-immobilized%2C+redox-modified+oligonucleotides+for+electrochemical+DNA+and+aptamer-based+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of electrode-immobilized, redox-modified oligonucleotides for electrochemical DNA and aptamer-based sensing.</a> Nat. Protocols. 2, 2875-2880 (2007).</li>
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<li>Zuo, X., Xiao, Y., Plaxco, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Specificity%2C+Electrochemical+Sandwich+Assays+Based+on+Single+Aptamer+Sequences+and+Suitable+for+the+Direct+Detection+of+Small-Molecule+Targets+in+Blood+and+Other+Complex+Matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">High Specificity, Electrochemical Sandwich Assays Based on Single Aptamer Sequences and Suitable for the Direct Detection of Small-Molecule Targets in Blood and Other Complex Matrices.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 6944-6945 (2009).</li>
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<li>Patterson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Triplex-Forming+Oligonucleotide+Probes+for+the+Reagentless%2C+Electrochemical+Detection+of+Double-Stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using Triplex-Forming Oligonucleotide Probes for the Reagentless, Electrochemical Detection of Double-Stranded DNA.</a> Analytical Chemistry. 82, 9109-9115 (2010).</li>
<li>Ferguson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Electrochemical+DNA+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Electrochemical DNA Sensor.</a> Analytical Chemistry. 81, 6503-6508 (2009).</li>
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</ol>

Una nota importante è che nessuno degli esperimenti descritti sopra funzioneranno correttamente a meno che gli elettrodi sono stati adeguatamente puliti. Ecco una guida per la nostra procedura di pulizia elettrochimica. Quando si lavora con CH potenziostati Instruments, corriamo queste operazioni di pulizia utilizzando una serie di tre programmi macro. Fase Zero (E-clean O) Immergere gli elettrodi nella 0.5MH 2 SO 4 e collegarli agli elettrodi di lavoro di un potenziostato. Anche allegare e immergere un riferimento Ag / AgCl e contro elettrodo di platino. Inizia con un passo di ossidazione (2 V per 5 s) e poi una fase di riduzione (0,35 V per 10 s). Phase One (E-clean 1) Avviare l&#39;ossidazione e riduzione scansioni alle stesse condizioni acide (0.5MH 2 SO 4) 0,35-1,5 V (20 scansioni a una velocità di scansione di 4 V / s ed un intervallo di campionamento di 0,01 V, seguito da quattro scansioni a una velocità di scansione di 0,1 V / s ed un intervallo di campionamento di 0,01 V). Fase Due (E-clean 2) Effettua un&#39;altra serie elettrochimica di ossidazione e riduzione scansioni in condizioni di acidità (0,01 M KCl/0.1 MH 2 SO 4) che coprono quattro campi diversi potenziali (tutti eseguiti per 10 segmenti ad una velocità di scansione di 0,1 V s 1 e un intervallo di campionamento di 0,01 V ): (i) campo di potenziale 0,2-0,75 V, (ii) Gamma potenziali 0,2-1,0 V, (iii) la gamma potenziale 0,2-1,25 V, (iv) la gamma potenziale 0,2-1,5 V. Molti tipi di elettrodi d&#39;oro possono essere utilizzate per condurre questi esperimenti. Oltre a elettrodi disco d&#39;oro come quelli impiegati qui, abbiamo avuto successo con superfici d&#39;oro microfabbricazione, filo d&#39;oro, e oro su circuiti stampati. Insieme con i sensori descritti in questo documento, molti altri elettrochimici architetture biosensore di DNA sono stati segnalati. Ciò include sensori con pseudoknot 12, triplo filo 13, panino 14, panino Super 15, o 16 triplex dell&#39;architettura. In futuro, ci aspettiamo che questi sensori verranno utilizzati nel punto di assistenza diagnostica medica. Sono state integrate con successo in diversi dispositivi microfluidici 17,18, e offrono molti vantaggi rispetto ai sistemi ottici di rilevamento analita. In particolare, questi sensori possono funzionare nel torbido, otticamente denso e altamente auto-fluorescente campioni.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Elettrodi disco d&#39;oro </td><td> CH Instruments </td><td> CHI101 </td><td> Possono essere riutilizzati </td></tr><tr><td> Sintetico sonda DNA </td><td> Biosearch Technologies </td><td> Costume </td><td></td></tr><tr><td> Obiettivo DNA sintetico </td><td> Sigma Genosys </td><td> Costume </td><td></td></tr><tr><td> Mercaptohexanol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 725226-1G </td><td> Conservare in luogo fresco e buio </td></tr><tr><td> Elettrodi di platino </td><td> BASI </td><td> MW-1032 </td><td> Possono essere riutilizzati </td></tr><tr><td> Ag / AgCl di riferimento </td><td> BASI </td><td> MF-2052 </td><td> Possono essere riutilizzati </td></tr><tr><td> Panno </td><td> Buehler </td><td> 40-7212 </td><td></td></tr><tr><td> Allumina polacco </td><td> Buehler </td><td> 40-6325-016 </td><td></td></tr><tr><td> Tampone fosfato tampone salino, pH 7,4 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P7059-1L </td><td></td></tr><tr><td> CH Instruments 605A </td><td> CH Instruments </td><td> 605A </td><td> Utilizzare qualsiasi potenziostato </td></tr><tr><td> Siero di vitello neonato </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N4637-500ML </td><td> Conservati congelati </td></tr><tr><td> NanoDrop </td><td> Fisher Scientific </td><td> ND-2000 </td><td> Utilizzare qualsiasi UV-Vis </td></tr><tr><td> PCR Mix </td><td> Bio-Rad </td><td> 170-8862 </td><td> Conservati congelati </td></tr><tr><td> Cocaina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C5776 </td><td> DEA o titolo richiesto </td></tr><tr><td> Procaina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9879 </td><td> Sostituto di cocaina </td></tr><tr><td> Anti-Flag anticorpo </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F1804-1mg </td><td></td></tr></tbody></table>

fabbricazione di elettrochimica-dna biosensori per il rilevamento reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

Come la medicina è attualmente praticata, i medici inviare i campioni a un laboratorio centrale per la verifica e quindi devono aspettare ore o giorni per ricevere i risultati. Molti pazienti sarebbero meglio serviti da una rapida, test capezzale. A tal fine il nostro laboratorio e altri hanno sviluppato una versatile piattaforma reagentless biosensore in grado di supportare il quantitativo, reagentless, rilevazione elettrochimica degli acidi nucleici (DNA, RNA), proteine ​​(compresi gli anticorpi) e piccole molecole di analiti direttamente trasformati in campioni clinici e ambientali. In questo video, ci dimostrano la preparazione e l&#39;impiego di biosensori diversi in questa categoria &quot;E-DNA&quot;. In particolare, fabbricare e dimostrare sensori per la rilevazione di una sequenza di DNA in una miscela di reazione a catena della polimerasi, un HIV-specifici anticorpi e la cocaina droga. La procedura di preparazione richiede solo tre ore di hands-on sforzo seguito da una notte di incubazione, e il loro uso richiede solo pochi minuti.

&quot;E-DNA&quot; sensori, reagentless, biosensori elettrochimici che ottengono buoni risultati anche quando sfidato direttamente nel sangue e altre matrici complesse, sono stati adattati per il rilevamento di una vasta gamma di acidi nucleici, proteine ​​e analiti di piccole molecole. Qui vi presentiamo una procedura generale per la fabbricazione e l&#39;uso di sensori di questo tipo.

Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

Nel modo in cui la medicina viene attualmente praticata, i medici inviano i campioni a un laboratorio centrale per l'analisi e devono pertanto attendere ore o giorni per riceverne i risultati. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare e utilizzare sensori elettrochimici di DNA. Questo viene ottenuto innanzitutto riducendo il DNA sonda e successivamente pulendo gli elettrodi d'oro sui quali vengono costruiti i sensori. Il passaggio successivo della procedura consiste nel depositare uno strato autoassemblato di tioli su oro contenente la sonda, DNA, sugli elettrodi d'oro.Successivamente, la superficie dell'elettrodo d'oro viene satura con mercaptoetanolo. Per garantire la formazione di un monolayer completo e ben organizzato, l'ultimo passaggio della procedura consiste nell'utilizzare i sensori e campioni come tampone, urina, siero o sangue. Infine, è possibile ottenere risultati che mostrano le concentrazioni dell'analita attraverso le variazioni della corrente di picco in voltammetria a onda quadra o in corrente alternata.Questa tecnica ha ampie implicazioni nella diagnostica molecolare poiché questi sensori possono rilevare molti biomarcatori e molecole farmacologiche direttamente nell'urina o nel siero. Il signor Aaron Rowe, uno studente laureato del mio gruppo di ricerca, illustrerà la procedura. Sarà assistito da due ricercatori post-dottorato che collaborano con noi, il dottor Ryan White e il dottor Andrew Bonham.Per iniziare, acquistare la sonda specifica e il DNA da un'azienda specializzata in sintesi di oligonucleotidi su misura; la sonda viene modificata durante la sintesi mediante l'aggiunta di un tiolo a sei atomi di carbonio all'estremità 5' e di un gruppo metilene blu redox-attivo all'estremità 3'. Sciogliere il DNA della sonda per ottenere una soluzione con una tinta blu visibile derivante dal residuo di metilene blu. Verificare la concentrazione misurando l'assorbanza a 260 nanometri, utilizzando uno spettrofotometro, per ridurre eventuali legami disolfuro presenti nella soluzione di DNA della sonda. Unire un microlitro della soluzione madre di DNA della sonda con due microlitri di soluzione TEP appena preparata.Mescolare delicatamente la soluzione ottenuta con una pipetta. Incubare la miscela per un'ora in un contenitore al buio e refrigerato. Durante l'incubazione, la soluzione blu dovrebbe diventare limpida poiché il TEP riduce in modo reversibile il blu di metilene.Successivamente, diluire la soluzione del sonda di DNA ridotta con tampone PBS alla concentrazione desiderata, che di solito è compresa tra 25 e 1000. La preparazione del sensore anomico inizia mescolando la polvere Illumina da 0,05 micron con acqua su un panno lucidante fine. Utilizzare questo panno per lucidare un set di elettrodi a disco d'oro premendo saldamente la superficie d'oro nel panno bagnato e muovendoli in un movimento a otto per circa tre minuti per ogni elettrodo.Risciacquare gli elettrodi lucidati con acqua deionizzata dopo il risciacquo. Immergerli in provette EOR riempite con acqua deionizzata. Successivamente, sottoporre gli elettrodi a sonificazione per cinque minuti per rimuovere qualsiasi residuo di polvere Illumina.Dopo la sonificazione, inserire gli elettrodi in una soluzione di acido solforico 0,5 molare. Quindi inserire un elettrodo di platino come elettrodo ausiliario e un elettrodo di riferimento al silvero/argento cloruro nella soluzione e collegarli a un potenziostato. Successivamente, eseguire una serie di voltammogrammi per pulire elettrochimicamente le superfici degli elettrodi.I dettagli di queste procedure sono inclusi nel supplemento scritto a questo video e in un articolo pubblicato su Nature Protocols dallo stesso gruppo. Successivamente, eseguire una seconda pulizia elettrochimica in una soluzione di KCL in acido solforico seguendo la procedura descritta in precedenza. In seguito, disporre un insieme di provette einor da due millilitri in Iraq e riempirne ciascuna con 200 microlitri della soluzione di DNA sonda.La concentrazione della sonda, il DNA in questa soluzione, determinerà la densità con cui il DNA della sonda viene assemblato sulla superficie del sensore e deve essere ottimizzata per ogni nuovo tipo di sensore. Risciacquare gli elettrodi a disco d'oro con acqua deionizzata. Successivamente, immergerli nella soluzione di sonda di DNA appropriata in un tubo einor per un'ora.A questo punto, il DNA sonda si lega alla superficie dell'elettrodo d'oro attraverso la formazione di un monolivello autoassemblato di tiolo sull'oro. Dopo aver risciacquato nuovamente gli elettrodi con acqua deionizzata, immergerli in un tubo einor contenente mercaptoetanolo due millimolare. Questo passaggio completa il riempimento della superficie, garantendo un monolivello autoassemblato completo e stabile.Per evitare l'evaporazione, sigillare gli elettrodi nel tubo einor con paraform. Conservare gli elettrodi immersi in un luogo buio a temperatura ambiente da tre ore a tutta la notte per garantire la completa formazione del monolivello autoassemblato. Per preparare il sensore all'uso dopo l'incubazione, risciacquare il sensore con acqua deionizzata e quindi immergerlo in tampone per almeno 10 minuti.La rilevazione del DNA mediante sensori viene dimostrata utilizzando una sonda di 17 nucleotidi legata a un elettrodo d'oro tramite un gruppo tiolico al suo estremo 5', mentre la sonda contiene un marcatore redox a blu di metilene al suo estremo 3'. Quando la molecola della sonda si ibrida con un filamento di cattura, la corrente elettrochimica prodotta dal sensore diminuisce. Per iniziare, risciacquare un sensore nuovo con acqua deionizzata e immergerlo in un campione bianco.Per registrare il segnale di fondo, eseguire una misurazione con onda quadra da zero a -0,6 volt con un'ampiezza di 25 millivolt e un incremento di tensione di un millivolt. La frequenza ottimale dell'onda quadra dipenderà dai dettagli dell'architettura della sonda. Dovrebbe apparire un picco arrotondato a circa -0,25 volt, il potenziale redox del blu di metilene.L'altezza della corrente di base rispetto a questo picco è proporzionale all'efficienza del trasferimento di elettroni tra il blu di metilene e l'elettrodo d'oro. Salvare questa misurazione di fondo. Successivamente, spostare gli elettrodi in una soluzione contenente la molecola di DNA bersaglio di interesse e lasciarli equilibrare.In alternativa, il DNA bersaglio può essere aggiunto alla soluzione in cui sono immersi i sensori. Registrare un secondo voltammogramma a onda quadra. L'altezza del picco a -0,25 volt cambierà rispetto alla misurazione iniziale del fondo.L'entità di questa variazione è correlata alla concentrazione dell'analita. Costituisce il dato principale in uscita dal sensore. Dopo la misurazione, calcolare la variazione relativa del segnale.Questa percentuale è spesso più riproducibile rispetto alla misurazione della variazione assoluta della corrente, poiché corregge le variazioni da elettrodo a elettrodo nell'area superficiale. Al termine della procedura, il sensore può essere rigenerato come descritto nella procedura scritta allegata per il rilevamento degli anticorpi. Utilizzando i sensori, il DNA modificato con blu di metilene e tiolo funge da filamento di ancoraggio ed è direttamente legato all'elettrodo d'oro.Questo viene quindi ibridato con una seconda sequenza di riconoscimento in DNA, legata covalentemente all'antigene specifico. Successivamente si procede aggiungendo un'incubazione con un anticorpo specifico per l'antigene. Eseguire il passaggio di ibridazione trasferendo un sensore prefabbricato in una provetta eppendorf contenente 100 nano molar della sequenza di riconoscimento specifica.Incubare il sensore con il filamento di DNA in PBS per un'ora. Successivamente, immergere il sensore in tampone PBS per rimuovere qualsiasi sonda non ibridata prima di trasferirlo nella soluzione bianca. Poi, posizionare il sensore nella soluzione bianca appropriata e inserire un elettrodo di platino come controelettrodo e un elettrodo di riferimento al silvero/argento cloruro nella soluzione.Collegare gli elettrodi al potenziostato. Eseguire la voltammetria a onda quadra come descritto in precedenza; la frequenza ottimale dell'onda quadra per l'architettura specifica della sonda utilizzata in questo esempio è di 60 hertz. Intorno a -0,25 volt dovrebbe apparire un picco arrotondato.Salvare questa misurazione di fondo. Trasferire gli elettrodi in una soluzione contenente l'analita bersaglio dopo un'incubazione da cinque a 60 minuti, raccogliere un secondo voltammogramma a onda quadra. Se l'anticorpo bersaglio è presente, il picco a -0,25 volt diminuirà.L'entità di questo cambiamento è correlata alla concentrazione dell'anticorpo. Per dimostrare il rilevamento di piccole molecole, il DNA sonda sulla superficie del sensore è un aptamer. Un aptamer è una molecola di DNA o RNA che è stata selezionata in vitro per legare un analita molecolare specifico.Gli aptameri possono spesso essere riprogettati per modificarne la struttura. L'aptamer utilizzato in questo caso cambia la propria conformazione in seguito al legame con la droga cocaina.Per iniziare, risciacquare un sensore nuovo con acqua deionizzata e immergerlo in un campione bianco, privo dell'analita, al fine di registrare il segnale di fondo che produce. Quindi inserire un elettrodo di platino come controelettrodo e un elettrodo di riferimento al silverio/cloruro di argento nella soluzione. Collegare gli elettrodi ai cavi di uno stat di potenziale ed eseguire una voltammetria a onda quadra o una voltammetria in corrente alternata.Come descritto in precedenza, la frequenza d'onda quadra ottimale per l'architettura specifica della sonda utilizzata qui è di 60 hertz. Nuovamente, dovrebbe apparire un picco arrotondato intorno a -0,25 volt, che deve essere salvato come misurazione di fondo. Successivamente, trasferire gli elettrodi in una soluzione contenente l'analita bersaglio.Dopo un'incubazione numero 32, raccogliere un secondo voltammogramma a onda quadra o in corrente alternata. L'altezza del picco a -0,25 volt cambierà. L'entità di questo cambiamento è correlata alla concentrazione dell'analita bersaglio.Quando vengono utilizzati biosensori elettrochimici per il DNA con l'architettura di sonda qui descritta, il segnale dovrebbe diminuire di almeno il 60%. Dopo essere stati equilibrati con un bersaglio di 200 nanomolar mediante tre risciacqui brevi in acqua deionizzata, il segnale dovrebbe tornare a un valore compreso tra lo 0,1 e il 5% del valore originale. Analogamente, quando i sensori qui descritti vengono utilizzati per rilevare anticorpi, il segnale dovrebbe diminuire tra il 40 e l'80% a seguito del legame dell'anticorpo. Al contrario, i sensori basati su aptameri per il rilevamento della cocaina mostrano un aumento del segnale fino al 200% a seguito del legame di piccole molecole.L'entità di questo cambiamento dipende dalla frequenza di interrogazione elettrochimica e dalla copertura superficiale dei sensori. Per il sensore di cocaina, è preferibile una copertura superficiale relativamente bassa. Una volta acquisita la padronanza, la fabbricazione e l'utilizzo di questi sensori possono essere eseguiti in un singolo giorno.È importante ricordare, durante l'esecuzione di questa procedura, che parametri come la frequenza dell'onda quadra o la densità della sonda sulla superficie dell'elettrodo influenzano notevolmente le prestazioni del sensore. Dopo aver visto questo video, saprai come preparare biosensori elettrochimici, biosensori a base di DNA, biosensori a base di aptameri e biosensori con struttura portante, e conoscerai il modo di utilizzarli per una vasta gamma di misurazioni di base. Gli unici rischi significativi in questo protocollo sono l'uso dell'acido solforico, che è ovviamente caustico, pertanto l'uso di protezioni per gli occhi e guanti è obbligatorio.

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