Fabbricazione di elettrochimica-DNA biosensori per il rilevamento Reagentless di acidi nucleici, proteine ​​e piccole molecole

"E-DNA" sensori, reagentless, biosensori elettrochimici che ottengono buoni risultati anche quando sfidato direttamente nel sangue e altre matrici complesse, sono stati adattati per il rilevamento di una vasta gamma di acidi nucleici, proteine ​​e analiti di piccole molecole. Qui vi presentiamo una procedura generale per la fabbricazione e l'uso di sensori di questo tipo.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare e utilizzare sensori elettrochimici di DNA. Ciò si ottiene riducendo prima il DNA della sonda e quindi pulendo gli elettrodi d'oro su cui sono costruiti i sensori. Il passo successivo della procedura consiste nel depositare un tiolo su un monostrato d'oro autoassemblato contenente la sonda, il DNA, sugli elettrodi d'oro.

Quindi la superficie dell'elettrodo d'oro viene riempita con mercaptoetanolo. Al fine di garantire la creazione di un monostrato completo e ben formato, la fase finale della procedura consiste nell'utilizzare i sensori e i campioni come tampone, urina, siero o sangue. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano le concentrazioni dell'analita attraverso variazioni della corrente di picco dell'onda quadra o dei volt di corrente alternata.

Questa tecnica ha implicazioni ad ampio raggio nella diagnostica molecolare perché questi sensori possono rilevare molti biomarcatori e molecole di farmaci diversi direttamente nelle urine o nel siero. Il signor Aaron Rowe, uno studente laureato nel mio gruppo di ricerca, dimostrerà la procedura. Sarà assistito da due borsisti post-dottorato che lavorano con noi, il Dr.Ryan White e il Dr.Andrew Bonham.

Per iniziare l'acquisto della sonda pertinente, il DNA da un'azienda di sintesi di oligonucleotidi personalizzata, la sonda viene modificata durante la sintesi con l'aggiunta di un tiolo a sei atomi di carbonio alla sua estremità principale a cinque e di un blu di metilene attivo redox alla sua estremità principale a tre dissolvenza del DNA della sonda per produrre una soluzione con una tinta blu visibile derivante dalla porzione blu di metilene. Verificare la sua concentrazione misurando la sua assorbanza a 260 nanometri, utilizzando uno spettrofotometro per ridurre eventuali legami disolfuro che potrebbero essere presenti nella soluzione di DNA della sonda. Combinare un microlitro della soluzione madre di DNA della sonda con due microlitri di soluzione TEP appena preparata.

Mescolare delicatamente la soluzione risultante con una pipetta. Incubare la miscela per un'ora in un contenitore refrigerato buio. Durante l'incubazione, la soluzione blu dovrebbe diventare limpida poiché il TEP riduce in modo reversibile il blu di metilene.

Successivamente, diluire la soluzione della sonda di DNA ridotto con tampone PBS alla concentrazione desiderata, che di solito è compresa tra 25 e 1000. La preparazione del sensore anomolare inizia con la combinazione di polvere Illumina da 0,05 micron con acqua su un panno lucidante fine. Utilizzare questo panno per lucidare una serie di elettrodi a disco d'oro premendo saldamente la superficie d'oro nel panno umido e muovendoli a forma di otto per circa tre minuti per elettrodo.

Sciacquare gli elettrodi lucidati con acqua deionizzata dopo il risciacquo. Immergerli in provette EOR riempite con acqua deionizzata. Quindi sonicare gli elettrodi per cinque minuti per rimuovere eventuali residui di polvere Illumina.

Dopo la sonicazione, posizionare gli elettrodi in una soluzione di acido solforico 0,5 molare. Quindi posizionare un controelettrodo di platino e un elettrodo di riferimento argento, cloruro d'argento nella soluzione e collegarli a uno statista di potenziale. Quindi eseguire una serie di volumi per pulire elettrochimicamente le superfici degli elettrodi.

I dettagli di queste procedure sono inclusi nel supplemento scritto a questo video e in un documento sui protocolli di natura precedentemente pubblicato da questo gruppo. Successivamente, eseguire una seconda pulizia elettrochimica in una soluzione di KCL in acido solforico secondo la procedura precedentemente descritta. Quindi, predisporre un set di provette da due millilitri in Iraq e riempire ciascuna con 200 microlitri della soluzione di DNA della sonda.

La concentrazione della sonda e del DNA in questa soluzione definirà la densità con cui il DNA della sonda è impacchettato sulla superficie del sensore e dovrebbe essere ottimizzata per ogni nuovo tipo di sensore. Sciacquare gli elettrodi a disco d'oro con acqua deionizzata. Quindi immergerli nella relativa sonda, la soluzione di DNA in una provetta einor per un'ora.

A questo punto, il DNA della sonda si attaccherà alla superficie dell'elettrodo d'oro attraverso la formazione di un tiolo su un monostrato autoassemblato d'oro. Dopo aver risciacquato nuovamente gli elettrodi con acqua deionizzata, immergerli in due millimolari di mercaptoetanolo in una provetta eoretica. Questo riempie la superficie garantendo un monostrato autoassemblato completo e stabile.

Per evitare l'evaporazione, sigillare gli elettrodi nel tubo einor con paraform. Conservare gli elettrodi immersi in un luogo buio a temperatura ambiente per tre ore o tutta la notte per garantire la completa formazione del monostrato autoassemblato. Per preparare il sensore per l'uso dopo l'incubazione, sciacquare il sensore con acqua deionizzata e quindi immergerlo in tampone per almeno 10 minuti.

La rilevazione del DNA con i sensori è dimostrata utilizzando un filamento di sonda a 17 nucleotidi fissato a un elettrodo d'oro tramite un tiolo sulla sua estremità a cinque prime, la sonda contiene un reporter redox blu di metilene alla sua estremità a tre prime. Quando la molecola della sonda si ibrida con un filamento di cattura, la corrente elettrochimica prodotta dal sensore diminuisce. Per iniziare, sciacquare un sensore fresco con acqua deionizzata e immergerlo in un campione bianco.

Per registrare il segnale di fondo, produce una misura di onda quadra da zero a 0,6 volt negativi con un'ampiezza di 25 millivolt e una tensione di passo di un millivolt. La frequenza ottimale dell'onda quadra dipenderà dai dettagli dell'architettura della sonda. Un picco arrotondato dovrebbe apparire a circa 0,25 volt negativi, il potenziale redox del blu di metilene.

L'altezza della corrente di base a questo picco è proporzionale all'efficienza del trasferimento di elettroni tra il blu di metilene e l'elettrodo d'oro. Salva questa misurazione in background. Quindi, sposta gli elettrodi in una soluzione che contiene la molecola di DNA bersaglio di interesse e lasciali equilibrare.

In alternativa, il DNA target può essere aggiunto alla soluzione in cui sono immersi i sensori. Raccogli un secondo volt a onda quadra Graham. L'altezza del picco a meno 0,25 volt cambierà rispetto alla misurazione iniziale del fondo.

L'entità di questa variazione è correlata alla concentrazione dell'analita. Sono i principali dati di uscita del sensore. Dopo la misurazione, calcolare la variazione relativa del segnale.

Questa percentuale è spesso più riproducibile rispetto alla misurazione della variazione assoluta della corrente, in quanto corregge le variazioni dell'area superficiale da elettrodo a elettrodo. Al termine della procedura, il sensore può essere rigenerato come descritto nella procedura scritta allegata per il rilevamento degli anticorpi. Utilizzando i sensori, il blu di metilene e il DNA modificato con tiolo fungono da filamento di ancoraggio e sono attaccati direttamente all'elettrodo d'oro.

Questo viene poi ibridato con un secondo filamento di DNA di riconoscimento, che è stato coniugato covalentemente all'antigene pertinente. A questo segue l'aggiunta di un'incubazione con un bersaglio anticorpale specifico. Effettuare la fase di ibridazione trasferendo un sensore prefabbricato in un tubo einor contenente 100 nano molari del relativo riconoscimento.

Il filamento di DNA in PBS incuba il sensore per un'ora. Seguire questo con l'immersione in tampone PBS per rimuovere qualsiasi sonda non ibridata prima di passare alla soluzione in bianco. Quindi, posizionare il sensore nella relativa soluzione bianca e posizionare un contatore di platino e un elettrodo di riferimento in argento, cloruro d'argento nella soluzione.

Collegare gli elettrodi alla statistica di potenziale. Eseguire la telemetria vol a onda quadra come descritto in precedenza, la frequenza d'onda quadra ottimale per la particolare architettura della sonda utilizzata in questo esempio è 60 hertz. Un picco arrotondato dovrebbe apparire intorno a 0,25 volt negativi.

Salva questa misurazione in background. Trasferire gli elettrodi in una soluzione contenente l'analita target dopo un'incubazione da cinque a 60 minuti, raccogliere una seconda volta a onda quadra. Se l'anticorpo bersaglio è presente, il picco a 0,25 volt negativi diminuirà.

L'entità di questo cambiamento è correlata alla concentrazione di anticorpi. Per dimostrare il rilevamento di piccole molecole, il DNA della sonda sulla superficie del sensore è un aptr. Un aptr è una molecola di DNA o RNA che è stata selezionata in vitro per legare uno specifico analita molecolare.

Gli aptameri possono spesso essere riprogettati per modificare la loro struttura. Su tale vincolo. L'aptima qui impiegato cambia la sua conferma al momento del legame con la droga cocaina.

Per iniziare, sciacquare un sensore fresco con acqua deionizzata e immergerlo in un campione bianco, privo del bersaglio, per registrare il segnale di fondo che produce. Quindi posizionare un contatore di platino e un riferimento di argento, cloruro d'argento nella soluzione. Collegare gli elettrodi ai conduttori di una statistica di potenziale, eseguire la telemetria a onda quadra o a volta a corrente alternata.

Come descritto in precedenza, la frequenza d'onda quadra ottimale per la particolare architettura della sonda utilizzata qui è di 60 hertz. Anche in questo caso, un picco arrotondato dovrebbe apparire intorno a 0,25 volt negativi e dovrebbe essere salvato come misurazione in background. Quindi trasferire gli elettrodi in una soluzione contenente l'analita target.

Dopo una 32a incubazione, raccogli una seconda onda quadra o volt a corrente alternata Graham. L'altezza del picco a meno 0,25 volt cambierà. L'entità di questa variazione è correlata alla concentrazione dell'analita target.

Quando i biosensori elettrochimici a DNA vengono utilizzati per rilevare il DNA con l'architettura della sonda qui descritta, il segnale dovrebbe diminuire di almeno il 60%Quando viene bilanciato con un bersaglio da 200 nanomolari dopo tre brevi risciacqui in acqua deionizzata, il segnale dovrebbe tornare entro lo 0,1-5% del suo valore originale. Allo stesso modo, quando i sensori qui descritti vengono utilizzati per rilevare gli anticorpi, il segnale dovrebbe diminuire tra il 40 e l'80% al legame dell'anticorpo. Al contrario, i sensori basati su aptima per la rilevazione della cocaina mostrano un aumento del segnale fino al 200% in caso di legame di piccole molecole.

L'entità di questo cambiamento dipende dalla frequenza di interrogazione elettrochimica e dalla copertura superficiale dei sensori. Per il sensore di cocaina. Una copertura superficiale relativamente bassa è la migliore Una volta padroneggiati, la fabbricazione e l'uso di questi sensori possono essere eseguiti in un solo giorno.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che parametri come la direzione quadrata, la frequenza o la densità della sonda sulla superficie dell'elettrodo influiscono notevolmente sulle prestazioni del sensore. Dopo aver visto questo video, saprai come preparare biosensori elettrochimici, biosensori del DNA, biosensori aptameri e biosensori dell'impalcatura e saprai come usarli per un'ampia varietà di misurazioni di base. Gli unici rischi significativi in questo protocollo sono l'uso di acido solforico, che ovviamente è caustico, la protezione degli occhi e i guanti sono obbligatori.