Name: Forno a microonde Assist diagnosi rapida di malattie virali piante da microscopia elettronica a trasmissione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Impara la diagnosi rapida di malattie virali nelle piante usando la microscopia elettronica a trasmissione con preparazione assistita da microonde. Questo metodo riduce il tempo di preparazione a circa due ore, permettendo una diagnosi chiara in mezza giornata.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo austriaco della scienza (FWF, P20619 e P22988 a BZ).

Microonde preparazione del campione assistita <ol><li> Prima dell'inizio di preparazione del campione bisogna programmare il processore automatico per tessuti microonde microscopia elettronica (EM Leica AMW; Microsystems Leica, Vienna, Austria) con i seguenti protocolli (Tabella 1) per la preparazione del campione per microonde assistita TEM: <img src="/files/ftp_upload/2950/2950table1.jpg" alt="Tabella 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabella 1"> Tabella 1. Protocollo per la preparazione del campione mediante irradiazione a microonde. Le colonne mostrano differenti (da sinistra a destra): <ol><li> Numero flaconcino (nr Vial.) Rappresenta l'ordine in cui è caricato il flacone nel carosello del processore. </li><li> Fase del processo vero e proprio. </li><li> Reagenti nelle fiale. </li><li> Durata della fase attuale. </li><li> Temperatura massima che si raggiunge nella fiala prima irradiazione con microonde è spento. </li><li> Forno a microonde impostazione irradiazione: continua = incrementi di temperatura rapidaase, tenendo la temperatura impostata; Slope = aumento di temperatura moderata, temperatura finale raggiunta al termine; Pulsed = rapido aumento di temperatura, alimentazione spento finché la temperatura è scesa a 5 ° C, potenza ripreso a temperatura. </li><li> Potenza massima della radiazione a microonde. </li></ol></li><li> Fresco preparare le soluzioni per le diverse fasi descritte nel protocollo di preparazione del campione (per Agar 100 resina epossidica vedi 1.7), riempirle nei flaconi designati secondo il protocollo programmato (Tabella 1), caricare le fiale sulla giostra, quindi inserire il giostra nel processore tessuto microonde, e infine caricare il primo flaconcino in modo mono-camera. </li><li> Tagliare piccole sezioni di foglie (1mm 2) di Nicotiana tabacum infettati con virus del mosaico del tabacco (TMV), con una lama di rasoio in un piatto ceroplastica in un calo del 3% glutaraldeide (Agar Scientific Ltd., Stansted, Inghilterra) in 60mm Sørensen tampone fosfato (pH 7,2) a temperatura ambienteteratura. </li><li> Trasferire le sezioni con le pinzette sottili immediatamente nei cesti designati con una larghezza delle maglie di circa 200μm. Stack i cestelli uno sopra l'altro e inserirle nella modalità mono-camera. Bisogna fare attenzione che i campioni sono costantemente ricoperti di soluzione fissativa durante il carico e accatastamento dei cestelli in modo che non si secchino. </li><li> Avviare il programmato in precedenza microonde assistita protocollo di preparazione del campione per la fissazione, la disidratazione e l'infiltrazione. </li><li> Durante la preparazione del campione viene eseguita automaticamente dal processore tessuto microonde continuare con colorazione negativa con il materiale vegetale residuo come descritto nella sezione 3 (colorazione negativa). </li><li> Preparata fresca Agar 100 resina epossidica miscelando i seguenti componenti come descritto: riempimento 24g Agar 100, 16g dodecenyl anidride succinica, e 10 g di anidride metil nadic (per tutti i componenti vedere Agar Scientific Ltd., Stansted, Inghilterra) in una tazza di plastica, di calore a40 ° C e mescolare bene. Aggiungere 1,2 g di benzile dimetilammina e mescolare accuratamente. Riempire Agar 100 resina epossidica nella polimerizzazione designato forma appena prima del protocollo di preparazione del campione giunge al termine (ad esempio durante la fase 22 in tabella 1). </li><li> Dopo che il protocollo è terminata (dopo passo 22 nella tabella 1) rilasciare i cestelli sovrapposti contenenti i campioni infiltrate dalla modalità mono-camera nel flaconcino ultimo della giostra. Rimuovere la giostra dal dispositivo a microonde, Affianca i cestelli e caricarle utilizzando pinzette sottili nelle forme di polimerizzazione designati. Bisogna fare attenzione che i campioni sono sempre ricoperti di Agar 100 resina epossidica durante disimpilamento e il caricamento in modo che non si secchino. </li><li> Impilare le forme di polimerizzazione sopra l'altro. Bisogna fare attenzione che i campioni sono sempre ricoperti di Agar 100 resina epossidica durante accatastamento e carico in modo che non si secchino. </li><li> Rimuovere le fiale precedentemente utilizzati dalla giostra del Tiss microondeue processore, caricarlo con i cesti impilati e inserire la giostra nel processore tessuto forno a microonde. </li><li> Avviare il protocollo di polimerizzazione programmato in precedenza (tabella 1). </li><li> Mentre polimerizzazione viene effettuata automaticamente dal processore tessuto microonde, esaminare griglie negativamente colorati con un microscopio elettronico a trasmissione [per esempio Philips CM10 TEM, FEI (ex Philips), Eindhoven, Paesi Bassi] ed eseguire analisi di immagine come descritto nel capitolo 3 e 4 ( colorazione negativa e analisi d'immagine). </li><li> Dopo che il protocollo è terminata rimuovere le forme di polimerizzazione dal mono-modalità camera, Unstack le forme di polimerizzazione e polimerizzate rimuovere i blocchi contenenti i campioni. Essi sono ora pronti per essere sezionato con un microtomo. </li></ol> 2. Taglio e sezionamento <ol><li> Inserisci uno o più blocchi in porta-campioni separati per ultrasottile sezionamento con il campione di incollaggio superiore a circa 1 cm dal supporto. </li><li>Tagliare il blocco con un trimmer campione per TEM (ad esempio Leica Reichert Ultratrim, Leica Microsystems) in modo che una faccia blocco di max. 1 mm in lunghezza e in larghezza 200μm che contiene materiale fogliare quanto possibile si ottiene (Block Size faccia potrebbe dover essere adattato alle dimensioni del coltello diamante). </li><li> Sezione del blocco con un ultramicrotomo (es. Reichert Leica Ultracut S; Microsystems Leica) utilizzando un coltello di diamante con un angolo di 45 ° coltello (es. DIATOME Ultra 45, Gröpl, Tulln, Austria). Spessore della sezione deve essere regolato a circa 70 a 90 nm e la velocità di taglio dovrebbe essere di circa 1 mm / s. Raccogliere più sezioni con un (Agar Scientific Ltd.) di rame ricoperto di nichel o formvar 200 griglia a maglie quadrate. </li><li> Post-macchia le sezioni sulla griglia di partenza con citrato di piombo (Agar Scientific Ltd., citrato di piombo 1,1 g sciolti in 42 ml di acqua bidistillata e 8ml 1N NaOH) per 5 minuti in una capsula di Petri parzialmente pieni di NaOH per creare un senza CO 2 ambiente e per 15 minuti con acetato di uranile 1% (Agar Scientific Ltd.) disciolto in acqua distillata a temperatura ambiente. Lavare le griglie con acqua distillata per 1 minuto tra ogni fase post-colorazione. Far asciugare le griglie in una casella della griglia. </li><li> Esaminare le sezioni con un microscopio elettronico a trasmissione (es. Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Paesi Bassi). </li></ol> 3. Colorazione negativa <ol><li> Raccolto circa 100mg di TMV materiale infetto foglia e preparare linfa grezzo mediante omogeneizzazione del materiale per 2 minuti con una lama di rasoio in un vetrino in 100 microlitri di 60mm Søfrensen tampone fosfato (pH 7,2). </li><li> Trasferire 20μl di omogenato risultante sul primo pozzetto di un vetrino rivestito teflon con 4 o più pozzetti (in alternativa è anche possibile trasferire l'omogeneizzato su un pezzo di parafilm). </li><li> Inserire una griglia formvar rivestito sopra l'omogenato con l'(Agar Scientific Ltd.) formvar lato patinato rivolto verso la caduta e incubate per 5 minuti. </li><li> Lavare la griglia 2 volte per 2 minuti ciascuno disponendo la griglia sopra due gocce di 200μl 60mm Sørensen tampone fosfato (pH 7,2). </li><li> Incubare la griglia per 1 minuto con una appena preparata di acido fosfotungstico al 2% (Agar Scientific Ltd.) in soluzione 60mm Sørensen tampone fosfato (pH 6,5). </li><li> Rimuovere la griglia e lasciare asciugare in una scatola griglia. </li><li> Esaminare la griglia con un microscopio elettronico a trasmissione (es. Philips CM10 TEM, FEI, Eindhoven, Paesi Bassi). Prendere almeno 10 immagini scelte a caso virioni colorazione negativa (almeno 10 o più virioni dovrebbero essere visibili su ogni immagine) con il microscopio elettronico a trasmissione ad un ingrandimento di primaria 21000X o superiore. Bisogna fare attenzione che tutte le immagini hanno lo stesso ingrandimento. </li></ol> 4. Analisi delle immagini <ol><li> Misurare la lunghezza e la larghezza di almeno 100 particelle scelte a caso singolo virus sulle micrografie prese dai campioni di colorazione negativa utilizzando qualsiasi software di analisi immagine del computer [per esempio cellule D (Olympus, Vita e Scienza dei Materiali Europe GmbH, Hamburg, Germania) con lo strumento di analisi di particelle o Optimas 6.5.1-(Media Cybernetics Inc., Bethesda, Maryland, USA)]. </li><li> Calcolare medie e deviazioni standard per ottenere una lunghezza e la larghezza media delle particelle virali individuate tramite metodi di colorazione negativa e TEM. </li><li> Confronta lunghezza e caratteristiche ultrastrutturali (ottenuta in 2.5) con dimensioni di virus e alterazioni ultrastrutturali indotte da malattie virali noti in letteratura per identificare chiaramente le malattie virali. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Dopo assistite campione microonde preparazione tipica alterazioni ultrastrutturali TMV indotte quali grandi aree contenenti virioni allineati in forma parallela potrebbe essere osservato con il microscopio elettronico a trasmissione nel citosol di infetto Nicotiana cellule tabacum (Fig. 1A). Inoltre, nella linfa grezza di TMV-infetta lascia particelle di TMV potrebbe essere osservata come flessuosi, astiformi strutture dopo colorazione negativa (Fig. 1B). L'analisi delle immagini di 100 particelle virali ha rivelato una dimensione media di TMV di 280 nm di lunghezza e 17Nm di larghezza (Fig. 2). L'ultrastruttura in TMV cellule infettate e le dimensioni dei virioni in questo studio sono risultati in accordo con proprietà ultrastrutturali TMV-indotte nel tabacco e l'intervallo di dimensioni delle particelle di TMV precedentemente riportato in letteratura 9-15. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Micrografie elettroniche di trasmissione di TMV-cellule infettate da foglia e virioni. A) L'immagine mostra l'ultrastruttura delle cellule del mesofillo TMV-infettati foglie di Nicotiana tabacum dopo la preparazione del campione centrale assistita a microonde. Si noti la grande area di virioni allineate parallele che hanno accumulato nel citosol.C = cloroplasto con amido (St), M = mitocondrio, N = nucleo, V = vacuolo, Bar = 2μm. B) L'immagine mostra virioni che sono stati individuati mediante colorazione negativa la linfa delle foglie infette. <img src="/files/ftp_upload/2950/2950fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Dimensione relativa di virioni. Distribuzione relativa della lunghezza e della larghezza del TMV-particelle dopo colorazione negativa la linfa delle foglie infette come apparivano al microscopio elettronico. I valori medi (media lunghezza / larghezza ± deviazione standard) sono stati calcolati da 100 virioni.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Forno a microonde assistita preparazione del campione impianto per TEM ha dimostrato di fornire i dati ultrastrutturali veloci e affidabili nel giro di poche ore 3,4,16. La conservazione multa strutturale di organelli e membrane ottenuti con il metodo utilizzato in questo studio era simile a campioni convenzionali e cryofixed 5,15 con il vantaggio di una drastica riduzione fissazione campione e l&#39;incorporamento di tempo da 3 giorni o più per circa 2 ore. Questo rappresenta il protocollo più veloce preparazione del campione per TEM attualmente disponibili in letteratura. Il metodo descritto in questo studio combinato microonde assistita impianto per la preparazione del campione TEM con metodi di colorazione negativa che ha consentito una identificazione chiara e rapida delle alterazioni ultrastrutturali TMV indotte e l&#39;agente virale stessa. TMV alterazioni indotte ultrastrutturali poteva essere analizzata dopo il taglio, sezionamento e post-colorazione entro circa 4 ore dopo l&#39;inizio del fissaggio nella trasmissione elettron microscopio. Utilizzando la modalità completamente automatica preparazione del provino liberato il ricercatore di condurre colorazione negativa nel frattempo, al fine di determinare le dimensioni e la larghezza del agente virale. Quindi, possiamo concludere che questo metodo permette una diagnosi chiara e rapida delle malattie delle piante virus in circa mezza giornata, che è di grande importanza per un uso futuro in esperimenti di agricoltura e scientifico in impianti fitopatologia. Poiché questo metodo potrebbe anche essere utilizzato per la diagnosi rapida di malattie umane e animali ha un grande potenziale per la futura applicazione in medicina veterinaria e patologia.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Glutaraldeide </td><td> Agar Scientific Ltd. </td><td> R1312 </td><td></td></tr><tr><td> Osmio tetrossido </td><td> Agar Scientific Ltd. </td><td> R1022 </td><td></td></tr><tr><td> Agar resina 100 </td><td> Agar Scientific Ltd. </td><td> R1043 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecenyl anidride succinica </td><td> Agar Scientific Ltd. </td><td> R1051 </td><td></td></tr><tr><td> Metile anidride nadic </td><td> Agar Scientific Ltd. </td><td> R1081 </td><td></td></tr><tr><td> Benzyl dimetilammina </td><td> Agar Scientific Ltd. </td><td> R1060 </td><td></td></tr><tr><td> Citrato di piombo </td><td> Agar Scientific Ltd. </td><td> R1210 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato di uranile </td><td> Agar Scientific Ltd. </td><td> R1260A </td><td></td></tr><tr><td> Acido fosfotungstico </td><td> Agar Scientific Ltd. </td><td> R1213 </td><td></td></tr><tr><td> Formvar </td><td> Agar Scientific Ltd. </td><td> R1202 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td> Leica EM AMW </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Leica (Reichert) Ultratrim </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Post più recente modello è disponibile </td></tr><tr><td> Leica (Reichert) Ultracut S </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Post più recente modello è disponibile </td></tr><tr><td> DIATOME Ultra 45 </td><td> Gröpl </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Philips CM10 TEM </td><td> FEI (ex Philips) </td><td> &lt;/ Td&gt; <td> Post più recente modello è disponibile </td></tr><tr><td> Cella D </td><td> Olympus Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Optimas 6.5.1 </td><td> Media Cybernetics Inc. </td><td></td><td> Post più recente versione è disponibile </td></tr></tbody></table>

forno a microonde assist diagnosi rapida di malattie virali piante da microscopia elettronica a trasmissione

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Le indagini sulle alterazioni ultrastrutturali indotte dal virus sono spesso necessario individuare chiaramente malattie virali nelle piante. Con la preparazione del campione convenzionale per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) che tali indagini può richiedere diversi giorni 1,2 e non sono quindi adatti per una rapida diagnosi di malattie virali delle piante. Fissazione microonde può essere utilizzata per ridurre drasticamente il tempo di preparazione del campione per TEM con risultati simili ultrastrutturali come osservato dopo convenzionalmente preparazione del campione 3-5. Molti diversi dispositivi a microonde su misura disponibile, che può essere impiegata per il fissaggio successo e incorporamento di campioni biologici per TEM 5-8. In questo studio abbiamo dimostrato il virus del mosaico del tabacco (TMV) piante infettate Nicotiana tabacum che è possibile diagnosticare alterazioni ultrastrutturali in foglie in circa mezza giornata utilizzando preparazione del campione assistita microonde per TEM. Abbiamo scelto di compiere questo studio con un dispositivo a microonde disponibile in commercio come effettua la preparazione del campione quasi completamente automatico 5 in contrasto con gli altri dispositivi disponibili dove molti passi devono essere ancora eseguite manualmente 6-8 e sono quindi più tempo e consumare manodopera. Come preparazione del campione è eseguita in modo completamente automatico la colorazione negativa di particelle virali nel linfa dei restanti TMV-foglie infette e l&#39;esame del seguente ultrastruttura e le dimensioni possono essere eseguite durante la fissazione e l&#39;inclusione.

Questo studio descrive un metodo che permette la diagnosi rapida e chiara delle malattie delle piante virus in circa mezza giornata, utilizzando una combinazione di preparazione dell&#39;impianto assistita campione microonde per microscopia elettronica a trasmissione e metodi di colorazione negativa.

Forno a microonde Assist diagnosi rapida di malattie virali piante da microscopia elettronica a trasmissione

Le indagini sui cambiamenti ultrastrutturali indotti dai virus sono spesso necessarie per identificare chiaramente le malattie virali nelle piante. Con il campionamento convenzionale...

L'obiettivo generale di questa procedura è diagnosticare le malattie virali delle piante entro poche ore mediante microscopia elettronica a trasmissione. Questa procedura inizia con la fissazione e l'inclusione assistita da microonde del materiale vegetale infetto. Il passaggio successivo consiste nell'estrazione e nella colorazione delle particelle virali dai campioni vegetali mediante colorazione negativa, seguita dal taglio a sezione dei campioni vegetali inclusi.I campioni vengono quindi analizzati al microscopio elettronico a trasmissione e la dimensione delle particelle virali viene misurata mediante analisi delle immagini. In definitiva, i risultati mostrano alterazioni ultrastrutturali tipiche indotte dal virus e la dimensione delle particelle virali attraverso metodi di microscopia elettronica a trasmissione. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la fissazione e l'inclusione convenzionali a temperatura ambiente, che possono richiedere diversi giorni, è che il tempo di preparazione del campione per la microscopia elettronica a trasmissione può essere ridotto a circa due ore, consentendo così una diagnosi chiara della malattia virale in circa mezza giornata.Insieme a me nella dimostrazione di questa procedura ci saranno Gerhard Kaba, un tecnico, e il Professor Zelnik, un collega del nostro laboratorio. Prima dell'inizio del programma di preparazione del campione, impostare il processore automatico di tessuti a microonde per microscopia elettronica LA A-E-M-A-M-W con i protocolli appropriati. Preparare le soluzioni per i diversi passaggi descritti nel protocollo programmato per fissazione, disidratazione e infiltrazione, e versarle nei flaconi designati secondo il protocollo; posizionare quindi i flaconi sul carosello. Inserire il carosello nel processore di tessuti a microonde, quindi caricare il primo flacone nella camera a modo singolo.Successivamente, ritagliare piccole sezioni di foglie di tabacco *Nicotiana* infette con il virus del mosaico del tabacco, o TMV, utilizzando una lametta su una piastra di cera da modellismo in una goccia di glutaraldeide in buffer fosfato di Sorensen a temperatura ambiente. Durante il prelievo dei campioni e il loro caricamento nei cestelli, è fondamentale assicurarsi che siano sempre ricoperti dalla soluzione fissativa in modo da non farli seccare. Utilizzando pinzette fini, trasferire immediatamente le sezioni nei cestelli designati con un’ampiezza della maglia di circa 200 micrometri.Impilare i cestelli uno sull'altro e inserirli nella camera a modo singolo. Avviare il protocollo preprogrammato di preparazione del campione assistito da microonde per la fissazione, la disidratazione e l'infiltrazione. Poco prima che il protocollo di preparazione del campione termini, versare la resina epossidica agar 100 appena preparata nelle forme designate per la polimerizzazione.Al termine del protocollo, rilasciare le cestelle impilate contenenti i campioni infiltrati dalla camera in modalità mono nell'ultima provetta del carosello. Rimuovere il carosello dal dispositivo a microonde ed estrarre la provetta contenente i campioni dal carosello. Successivamente, rimuovere le cestelle dalla provetta e separarle utilizzando pinzette fini.Caricare i campioni nelle forme designate per la polimerizzazione. Successivamente, impilare le forme di polimerizzazione una sull'altra e rimuovere i vial precedentemente utilizzati dal carosello del processore tessutale a microonde. Caricare il carosello con i cestelli impilati e inserire il carosello nel dispositivo a microonde.Ora avviare il protocollo di polimerizzazione precedentemente programmato. Al termine del protocollo, rimuovere i contenitori di polimerizzazione dalla camera a modo singolo e separarli. Estrarre i blocchi polimerizzati contenenti i campioni, che sono ora pronti per essere sezionati con un microtomo per iniziare la procedura di sezionamento dei blocchi contenenti i campioni.Inserire uno o più blocchi in portacampioni separati per il taglio ultratenue. Con il campione rivolto verso l'alto, facendolo sporgere dal portacampione di circa un centimetro. Modellare il blocco con un trimmer per TEM in modo da ottenere una faccia del blocco di lunghezza massima di un millimetro e larghezza di 200 micrometri, contenente la maggior quantità possibile di materiale fogliare.Impostare l'ultramicrotomo per tagliare sezioni di circa 70-90 nanometri di spessore a una velocità di taglio di circa un millimetro al secondo. Procedere al taglio del blocco utilizzando un coltello al diamante con un angolo del coltello di 45 gradi. Raccogliere più sezioni con una griglia quadrata in rame o nichel ricoperta con film VAR da 200 maglie, quindi colorare le sezioni sulla griglia con citrato di piombo per cinque minuti in una piastra di Petri parzialmente riempita con NaOH per creare un ambiente privo di CO2.Lavare le griglie con acqua distillata per un minuto. Infine, eseguire la colorazione post-fixativa per 15 minuti con acetato di uranile all'1% disciolto in acqua distillata a temperatura ambiente dopo aver lavato le griglie con acqua distillata per un minuto, quindi far asciugare all'aria in una scatola per griglie. La colorazione negativa del materiale vegetale rimanente viene eseguita mentre la preparazione del campione è in corso automaticamente tramite il processore di tessuti a microonde.Prima di tutto, raccogliere circa 100 milligrammi di materiale fogliare infetto da TMV e preparare un estratto grezzo (SAP) omogeneizzando il materiale per due minuti con una lametta su un vetrino in tampone fosfato e soren. Trasferire 20 microlitri dell'omogenato ottenuto nel primo pozzetto di un vetrino ricoperto di teflon.Scorrere con quattro o più pozzetti. Quindi posizionare una griglia rivestita con form VAR sopra l'omogenato, con il lato rivestito con form VAR rivolto verso la goccia, e incubare per cinque minuti. Lavare la griglia per due minuti posizionandola sopra una goccia di tampone fosfato di Sorensen.Ripetere il lavaggio per altri due minuti. Successivamente, incubare la griglia per un minuto con una soluzione appena preparata di acido fosfo-tungstico. Dopo un minuto, rimuovere la griglia e lasciarla asciugare all'aria.In una cassetta a griglia, inserire la griglia colorata negativamente nel portacampioni ed esaminarla con un microscopio elettronico a trasmissione. Mentre la polimerizzazione viene eseguita automaticamente dal processore di tessuti a microonde, acquisire almeno 10 immagini di ioni colorati negativamente scelti casualmente. Su ciascuna immagine devono essere visibili almeno 10 ioni o più.Con il microscopio elettronico a trasmissione a un'ingrandimento primario di 21.000 x o superiore, è necessario prestare attenzione affinché tutte le immagini abbiano lo stesso ingrandimento. Le sezioni contenenti i campioni di tessuto processati automaticamente dal processore di tessuti a microonde vengono inoltre esaminate con un microscopio elettronico a trasmissione. L'analisi delle immagini acquisite mediante TEM può essere eseguita utilizzando qualsiasi software di analisi delle immagini.Software informatico dotato di uno strumento di analisi delle particelle. Misurare la lunghezza e la dimensione di almeno 100 particelle virali singole scelte casualmente sulle microfotografie ottenute dai campioni colorati negativamente. Calcolare le medie e le deviazioni standard al fine di ottenere una lunghezza e larghezza media delle particelle virali visualizzate mediante metodi di colorazione negativa e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) dopo la preparazione del campione assistita da microonde.Alterazioni ultrastrutturali tipiche indotte dal TMV, come ampie aree contenenti ioni allineati in forma parallela, possono essere osservate al microscopio elettronico a trasmissione nel citosol di cellule di tabacco *Nicotiana* infette. In questa microfotografia al microscopio elettronico a trasmissione, C rappresenta un cloroplasto con amido, St.M indica un mitocondrio, N indica il nucleo e V indica una vacuolo.Inoltre, nel succo crudo di foglie infette da TMV, le particelle di TMV potevano essere osservate come strutture allungate a forma di bastoncino dopo la colorazione negativa. Figura uno B. Questo grafico mostra la distribuzione relativa di lunghezza e larghezza di 100 particelle di TMV così come sono apparse al microscopio elettronico. Dopo la colorazione negativa, l'analisi dell'immagine delle particelle virali nel succo delle foglie infette ha rivelato una dimensione media per il TMV di 280 nanometri in lunghezza e 17 nanometri in larghezza dopo il suo sviluppo per la diagnosi rapida delle malattie virali cerebrali.Questa tecnica potrebbe aprire la strada ai ricercatori nei campi della patologia animale e umana per diagnosticare rapidamente le malattie degli animali e dell'uomo mediante microscopia elettronica a trasmissione B.

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