Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo

Una delle sfide dello studio dello sviluppo nelle neuroscienze è catturare le morfologie dendritiche e assonali a livello di singola cellula in vivo. Nel sistema olfattivo, i neuroni sensoriali olfattivi estendono i loro assoni dall'epitelio olfattivo nel naso al bulbo olfattivo nel cervello. Quando più neuroni sensoriali olfattivi si proiettano verso il bulbo olfattivo, si fasciano in fasci.

Ciò complica lo studio delle traiettorie dei singoli assoni e delle loro morfologie terminali. Abbiamo sviluppato un metodo per visualizzare singoli neuroni sensoriali olfattivi in vivo mediante microiniezione di un costrutto GFP. Portatore di lentivirus.

La trasduzione riuscita con lentivirus illumina l'intera lunghezza dell'assone sensoriale olfattivo, compreso l'albero terminale. Oltre a visualizzare singoli neuroni sensoriali olfattivi, questo metodo ci permette di manipolare l'espressione genica di un particolare gene di interesse per studiarne la funzione in un contesto in vivo. Questa procedura per il lentivirus è di livello due di biosicurezza e deve essere eseguita in una cappa a flusso laminare.

Per mantenere un ambiente sterile, spruzzare tutto ciò che è inserito nella cappa con etanolo al 70% nella cappa, preparare e preriscaldare un letto ad acqua a 37 gradi per almeno 20 minuti. Prima dell'iniezione. Sigillare un sacchetto di plastica mezzo pieno d'acqua e posizionarlo su un'incubatrice a blocchi riscaldanti vuota.

Ciò consentirà ai topi di riprendersi dopo l'iniezione. Riempi un contenitore per rifiuti a rischio biologico con il 10% di candeggina per decontaminare tutto il materiale esposto ai virus. Da questa procedura, preparare un piccolo piatto aperto di etanolo al 70% e un secondo piatto con acqua distillata sterile.

In una cappa a flusso laminare, utilizzeremo una siringa Hamilton da cinque microlitri con un ago da 33 gauge. Questo particolare modello consente di regolare la resistenza dello stantuffo ruotando una manopola di tensione situata nella parte superiore della camera dello stantuffo. Questa funzione fornisce il controllo del volume di microiniezione per sterilizzare l'ago e la camera della siringa.

Aspirare ed espellere ripetutamente l'etanolo dalla capsula più volte. Sciacquare la cartuccia della siringa aspirando ed espellendo più volte l'acqua sterile. Posizionare la siringa in modo sicuro nella cappa di flusso.

Disporre le salviettine imbevute di alcol vicino alla stazione di iniezione. Preparare una fase di iniezione che fornisca una superficie rialzata che faciliti il posizionamento del mouse. Si può usare un piatto di coltura rovesciato di 10 centimetri coperto con salviette Kim.

I cuccioli di topo possono essere anestetizzati mediante ipotermia fino all'età dello svezzamento. Ritaglia un dito di un guanto di gomma e posiziona il cucciolo di topo nel taglio del dito. Quindi mettere sul ghiaccio per cinque minuti.

Il guanto previene le ustioni cutanee che si verificherebbero dal contatto diretto della pelle con il test del ghiaccio per un'anestesia accurata pizzicando la parte posteriore e quattro zampe del cucciolo per assicurarsi che l'animale non risponda. Ora siamo pronti per la microiniezione di lentivirus. Dimostreremo con un cucciolo neonatale.

Se si utilizza un topo di età avanzata, si dovrebbe sostituire l'ago calibro 33 con un ago di calibro più spesso per penetrare la superficie del cranio. Sterilizzare la superficie del naso del mouse strofinandola con un tampone imbevuto di alcol. Rimuovere le scorte di lentivirus dal congelatore e scongelarle con ghiaccio.

Abbiamo prodotto noi stessi il lentivirus in laboratorio utilizzando metodi consolidati. Nello sviluppo di questo metodo, abbiamo scoperto che per un buon tasso di trasduzione è necessario un titolo virale minimo da 10 a none unità infettive per mil. Aspirare due microlitri di soluzione madre di lentivirus nella siringa di Hamilton sterilizzata.

Posizionare il cucciolo di topo sopra la fase di iniezione. Afferra la pelle sulla parte superiore della testa all'altezza delle orecchie e tira delicatamente indietro. Abbiamo dotato la nostra cappa di flusso di un cannocchiale da dissezione.

Per dirigere con precisione le microiniezioni, cercare sulla superficie dorsale del cranio al proencefalo un contorno del bulbo olfattivo. I nostri obiettivi di microiniezione circondano strettamente il bulbo olfattivo, ma non dovrebbero includere il bulbo stesso. Facciamo quattro iniezioni nell'epitelio olfattivo di ogni cucciolo.

Queste posizioni rappresentate da punti blu richiedono che l'ago sia inserito con un angolo diretto medialmente. Le due iniezioni aggiuntive rappresentate da punti verdi sono sfalsate, più medialmente e anteriormente al bulbo olfattivo. Queste iniezioni possono essere angolate in modo coddly.

I suggerimenti sugli angoli dell'ago sono fatti in considerazione del posizionamento ventrale dell'epitelio olfattivo, che è per lo più situato sotto il bulbo olfattivo. L'accesso perpendicolare è quindi limitato. Inserire l'ago attraverso la parte superiore della cavità nasale a circa tre millimetri sotto la superficie della pelle.

Per raggiungere l'epitelio olfattivo. Una mano allenata dovrebbe sentire il calo di resistenza quando viene raggiunto lo spazio luminale della cavità nasale. Questa zona dovrebbe essere evitata.

Micro iniettare 0,5 microlitri di soluzione madre virale per posizione. Anche in questo caso, scegliendo due siti per lato, sia sinistro che destro, quattro iniezioni totali da 0,5 microlitri. Ciascuno per topo significa due microlitri di virus necessari per topo in una singola sessione di iniezione.

Anche in questo caso, fare attenzione a non iniettare la macchia olfattiva del bulbo a secco, eventuali residui, soluzioni virali o sangue che potrebbero fuoriuscire dal sito di iniezione o dalle aperture delle narici. Utilizzando una salvietta a base di etanolo, gettare le salviette nel contenitore sbiancato liquido diluito, posizionare immediatamente il topo iniettato sull'incubatrice a letto ad acqua per il recupero. Decontaminare la siringa dell'ago ripetendo la procedura di sterilizzazione eseguita durante la preparazione I topi iniettati possono essere rimessi nella loro gabbia 30 minuti dopo il recupero sull'incubatrice a letto ad acqua.

L'intera microiniezione può essere ripetuta di nuovo dopo quattro ore. Se si desidera aumentare il numero di neuroni sensoriali olfattivi che verranno infettati, i neuroni sensoriali olfattivi infetti possono essere visualizzati per tutta la lunghezza della cellula in soli tre giorni. Gli animali sacrificati e perfusi per l'osservazione nel momento desiderato.

Al fine di visualizzare le traiettorie dei neuroni sensoriali olfattivi a singola cellula trasdotta e i terminali degli assoni, sezioniamo e sezioniamo il bulbo olfattivo coronale a uno spessore di 60 micron. La sezione conterrà quindi tutti gli strati cellulari del bulbo olfattivo, compresi i fasci di assoni dei neuroni sensoriali olfattivi e i terminali degli assoni, che sinapsi in strutture glomerulari legate alla superficie del bulbo in preparazione per l'immunoistochimica fluttuante. Le sezioni seriali del bulbo olfattivo vengono realizzate e spazzate collettivamente in un piatto di coltura di 10 centimetri con cinque millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato.

Trasferire le sezioni galleggianti in una fiala conica da 50 millilitri. Una volta che le sezioni si sono depositate sul fondo della fiala, aspirare la soluzione salina tamponata con fosfato. Fare attenzione a non aspirare.

Le sezioni si riempiono con 10 millilitri di tampone fresco per lavare via qualsiasi residuo di materiale fissativo o di inclusione. Pipettare immediatamente questa risospensione in una fiala conica da 15 millilitri, assicurandosi di catturare tutte le sezioni galleggianti, aspirare la soluzione di risciacquo e perforare le sezioni con una soluzione di Triton X 100 allo 0,3% in soluzione salina tampone fosfato posta su una piattaforma a bilanciere per 10 minuti. A temperatura ambiente, è possibile procedere con un protocollo di immunocolorazione standard nella stessa fiala conica, ripetendo le fasi di vuoto e bilanciere secondo necessità per recipienti di queste dimensioni, mantenere un volume di 10 millilitri per le fasi di colorazione e risciacquo.

Ecco un elenco di anticorpi che usiamo per colorare i neuroni sensoriali olfattivi trasdotti positivamente e la popolazione generale di neuroni sensoriali olfattivi. Per una penetrazione completa degli anticorpi nelle sezioni del bulbo da 60 micron, si consiglia di incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Anche la profondità di lavaggio non deve essere inferiore a 20 minuti ciascuno.

Stendere delicatamente ogni sezione su un vetrino con un pennello, montare ogni vetrino con flora Mount G integrato con una soluzione di colorante di cromatina. Sforzarsi di eliminare tutte le bolle dal supporto di montaggio. Monta le sezioni in file per semplificare la successiva fase di retinatura.

Scansiona questi strati sulle sezioni del bulbo della macchia immuno per le fibre assoniche e i terminali GFP positivi. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, le terminazioni nervose infettate positivamente possono quindi essere visualizzate mediante microscopia confocale. È utile calibrare il piano focale nell'area di interesse utilizzando i canali proteici DPI e marcatori olfattivi.

Questi risultati mostrano che un singolo neurone sensore olfattivo, la fibra dell'assone e il terminale dell'assone all'interno del glomerulo, che è CO con la proteina marcatore olfattiva in rosso e vlu, due in grigio, i corpi cellulari dei neuroni sensore olfattivi infetti e la loro manopola dendritica possono anche essere visualizzati all'interno dell'epitelio olfattivo se questo tessuto è stato incluso nelle fasi di dissezione e immunocolorazione. Ciao, la mia proiezione confocale ci fornisce una morfologia molto dettagliata di un singolo neurone sensoriale olfattivo, del percorso di estensione assonale e dell'albero terminale. Si può vedere l'aggancio della fibra dell'assone verso il suo bersaglio glomerulare, così come i dettagli del suo modello di ramificazione all'interno della pillola neuro glomerulare.

Il metodo di microiniezione lentivirale consente la visualizzazione di singoli assoni cellulari, morfologie dei neuroni sensoriali olfattivi e consente studi che manipolano l'espressione genica, la trasduzione del lentivirus si traduce in un'integrazione genomica stabile dei costrutti. Il lentivirus non infetta in modo trans sinaptico le cellule vicine. La visualizzazione può essere ottenuta in soli tre giorni ed è stato confermato che dura almeno tre mesi e probabilmente persiste per periodi più lunghi.

I neuroni sensoriali olfattivi non sono facilmente infettati dall'infusione nasale di una soluzione di lentivirus. Pertanto, in questa procedura è necessaria la microiniezione attraverso la superficie. Questa è la nostra procedura di microiniezione di lentivirus.

Spero che tu abbia trovato tutte queste informazioni utili per ottenere morfologie unicellulari della tua caccia felice.