Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo

Una delle sfide nello studio dello sviluppo nelle neuroscienze è catturare le morfologie dendritiche e assonali a livello di singola cellula in vivo. Nel sistema olfattivo, i neuroni sensoriali olfattivi estendono i loro assoni dall'epitelio olfattivo nel naso fino al bulbo olfattivo nel cervello. Poiché numerosi neuroni sensoriali olfattivi si proiettano verso il bulbo olfattivo, si raggruppano in fasci.

Questo complica lo studio delle traiettorie individuali degli assoni e delle loro morfologie terminali. Abbiamo sviluppato un metodo per visualizzare singoli neuroni sensoriali olfattivi in vivo mediante microiniezione di un costrutto GFP portatore di lentivirus.

Una trasduzione riuscita con lentivirus illumina l'intera lunghezza dell'assone del neurone sensoriale olfattivo, inclusa l'arborizzazione terminale. Oltre alla visualizzazione di singoli neuroni sensoriali olfattivi, questo metodo ci consente di manipolare l'espressione genica di un particolare gene di interesse per studiarne la funzione in un contesto in vivo. Questa procedura con lentivirus richiede un livello di sicurezza biologica due e deve essere eseguita all'interno di una cappa a flusso laminare.

Per mantenere un ambiente sterile, spruzzare con etanolo al 70% tutti gli oggetti inseriti nell'incubatore, preparare e preriscaldare un lettino riscaldato a 37 gradi per almeno 20 minuti prima dell'iniezione. Sigillare un sacchetto di plastica riempito a metà con acqua e posizionarlo su un blocco riscaldante vuoto dell'incubatore.

Questo permetterà ai topi di riprendersi dopo l'iniezione. Riempire un contenitore per rifiuti biologici con una soluzione al 10% di candeggina per decontaminare tutti i materiali esposti al virus. A partire da questa procedura, preparare una piccola capsula aperta contenente etanolo al 70% e una seconda capsula con acqua distillata sterile.

In una cappa a flusso laminare, utilizzeremo una siringa Hamilton da cinque microlitri con un ago da 33 gauge. Questo modello specifico consente di regolare la resistenza del pistone ruotando una manopola di tensione situata nella parte superiore della camera del pistone. Questa caratteristica permette il controllo del volume di microiniezione e la sterilizzazione dell'ago e della camera della siringa.

Aspirare ed espellere ripetutamente l'etanolo dalla piastra diverse volte. Sciacquare la cartuccia della siringa aspirando ed espellendo acqua sterile diverse volte. Mettere la siringa in un luogo sicuro all'interno della cappa a flusso laminare.

Posizionare salviette alcoliche vicino alla stazione di iniezione. Preparare una piattaforma per iniezioni che offra una superficie rialzata per facilitare il posizionamento del topo. È possibile utilizzare una piastra di coltura da 10 centimetri capovolta, ricoperta con salviette Kim.

I cuccioli di topo possono essere anestetizzati mediante ipotermia fino all'età断 weaning. Ritagliare un dito da un guanto di gomma e inserire il cucciolo di topo nel ritaglio del dito. Successivamente, posizionare sul ghiaccio per cinque minuti.

Il guanto eviterà scottature cutanee che potrebbero verificarsi a causa del contatto diretto della pelle con il test del ghiaccio per verificare un’anestesia completa, pizzicando le zampe posteriori e anteriori del cucciolo per assicurarsi che l’animale non reagisca. Ora siamo pronti per la microiniezione del lentivirus. Illustreremo la procedura utilizzando un cucciolo neonato.

Se si utilizza un topo di età più avanzata, si dovrebbe sostituire l'ago da 33 gauge con un ago di gauge più spesso per poter penetrare la superficie del cranio. Sterilizzare la superficie del naso del topo passandovi un batuffolo di alcol. Rimuovere le scorte di lentivirus dal congelatore e scongelarle sul ghiaccio.

Abbiamo prodotto lentivirus in laboratorio seguendo metodi consolidati. Nello sviluppo di questo metodo, abbiamo riscontrato che è necessaria una titolazione virale minima di 10 alla nona unità infettive per millilitro per ottenere un buon tasso di trasduzione. Aspirare due microlitri di soluzione stock di lentivirus nella siringa sterile di Hamilton.

Posizionare il topo neonato sulla piattaforma di iniezione. Afferrare la pelle sulla sommità della testa a livello delle orecchie e tirare delicatamente all'indietro. Abbiamo dotato il nostro armadio a flusso laminare di un microscopio stereoscopico.

Per indirizzare con precisione le microiniezioni, cercare sulla superficie dorsale del cranio, a livello del proencefalo, il profilo del bulbo olfattivo. I nostri bersagli per le microiniezioni circondano strettamente il bulbo olfattivo, ma non devono includere il bulbo stesso. Effettuiamo quattro iniezioni nell'epitelio olfattivo di ogni cucciolo.

Queste posizioni, indicate con puntini blu, richiedono che l'ago venga inserito con un angolo orientato medialmente. Le due iniezioni aggiuntive, indicate con puntini verdi, sono sfalsate, più medialmente e anteriormente rispetto al bulbo olfattivo. Queste iniezioni possono essere eseguite con un angolo leggermente obliquo.

Le raccomandazioni relative all'angolazione dell'ago tengono conto della posizione ventrale dell'epitelio olfattivo, che si trova principalmente al di sotto del bulbo olfattivo. L'accesso perpendicolare è pertanto limitato. Inserire l'ago attraverso la parte superiore della cavità nasale, circa tre millimetri al di sotto della superficie della pelle.

Per raggiungere l'epitelio olfattivo. Una mano esperta dovrebbe percepire la diminuzione della resistenza quando si raggiunge lo spazio luminale della cavità nasale. Quest'area deve essere evitata.

Microiniettare 0,5 microlitri di soluzione virale per posizione. Ancora una volta, scegliendo due siti per lato, sia a sinistra che a destra, per un totale di quattro iniezioni di 0,5 microlitri. Ciascuna per topo significa due microlitri di virus necessari per topo in una singola sessione di iniezione.

Anche in questo caso, fare attenzione a non iniettare nel bulbo olfattivo residui di soluzione virale o sangue che potrebbero fuoriuscire dal sito di iniezione o dalle aperture nasali. Utilizzando un panno imbevuto di etanolo, smaltire i tamponi nel contenitore con soluzione di candeggina diluita e posizionare immediatamente il topo iniettato nell'incubatrice ad acqua per il recupero. Decontaminare la siringa con ago ripetendo la procedura di sterilizzazione eseguita durante la preparazione. I topi iniettati possono essere rimessi nella gabbia 30 minuti dopo il recupero nell'incubatrice ad acqua.

Questa intera microiniezione può essere ripetuta nuovamente dopo quattro ore. Se si desidera aumentare il numero di neuroni sensoriali olfattivi che verranno infettati, i neuroni sensoriali olfattivi infettati possono essere visualizzati lungo tutta la lunghezza della cellula già in soli tre giorni. Gli animali vengono sacrificati e perfusi per l'osservazione al momento desiderato.

Utilizzando metodi standard per visualizzare le traiettorie dei neuroni sensoriali olfattivi transdotti a livello di singola cellula e i loro assoni terminali, si procede con la dissezione e il taglio del bulbo olfattivo in sezioni coronali di uno spessore di 60 micron. La sezione conterrà quindi tutti gli strati cellulari del bulbo olfattivo, inclusi i fasci di assoni dei neuroni sensoriali olfattivi e le terminazioni assoniche, che sinaptano in strutture glomerulari localizzate alla superficie del bulbo, in preparazione per l'immunohistochimica in sospensione. Si eseguono sezioni seriali del bulbo olfattivo, che vengono raccolte complessivamente in una piastra di coltura da 10 centimetri contenente cinque millilitri di soluzione salina fosfato tampone.

Trasferire le sezioni galleggianti in un vial conico da 50 millilitri. Una volta che le sezioni si sono depositate sul fondo del vial, aspirare il tampone salino fosfato. Fare attenzione a non aspirare le sezioni.

Si rinnovano i campioni aggiungendo 10 millilitri di tampone fresco per eliminare qualsiasi fissativo residuo o materiale di inclusione. Si pipetta immediatamente questa sospensione in un tubo conico da 15 millilitri, assicurandosi di recuperare tutti i campioni galleggianti, si aspira la soluzione di lavaggio e si permeabilizzano i campioni con una soluzione di Triton X-100 0,3% in soluzione salina fosfato, quindi si pone il tubo su un agitatore rotante per 10 minuti. A temperatura ambiente, si può quindi procedere con un protocollo standard di immunomarcatura nello stesso tubo conico, ripetendo le fasi di aspirazione e agitazione secondo necessità per questo tipo di contenitore, mantenendo un volume di 10 millilitri per le fasi di marcatura e lavaggio.

Di seguito è riportato un elenco di anticorpi che utilizziamo per la colorazione congiunta di neuroni sensoriali olfattivi positivamente trasdotti e della popolazione generale di neuroni sensoriali olfattivi. Per garantire una penetrazione completa degli anticorpi nei tagli del bulbo di 60 micron, si raccomanda un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. Anche i lavaggi devono avere una durata non inferiore a 20 minuti ciascuno.

Stendere delicatamente ciascuna sezione su un vetrino con un pennello, montando ogni vetrino con il Mount G per flora integrato con soluzione colorante per la cromatina. Prestare attenzione a eliminare tutte le bolle dal mezzo di montaggio. Montare le sezioni in file per semplificare il successivo passaggio di screening.

Scansionare questi strati nei preparati di bulbo olfattivo colorati per immunomarcatura alla ricerca di fibre assonali e terminazioni positive per GFP. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, le terminazioni nervose positivamente infette possono quindi essere analizzate mediante microscopia confocale. È utile calibrare il piano focale nella zona di interesse utilizzando i canali DPI e della proteina marcatrice olfattiva.

Questi risultati mostrano una singola fibra assonale e un terminale assonale di un neurone sensoriale olfattivo all'interno del glomerulo, che è colorato in rosso con la proteina marcatrice olfattiva (CO) e in grigio con vlu due. I corpi cellulari dei neuroni sensoriali olfattivi infettati e i loro bottoni dendritici possono essere visualizzati anche all'interno dell'epitelio olfattivo, qualora questo tessuto sia stato incluso nei passaggi di dissezione e immunomarcatura. La mia proiezione al microscopio confocale ci fornisce una morfologia estremamente dettagliata del percorso di estensione assonale e dell'arborizzazione terminale di un singolo neurone sensoriale olfattivo. È possibile osservare il ripiegamento della fibra assonale verso il suo bersaglio glomerulare, nonché i dettagli del suo modello di ramificazione all'interno della neuropila glomerulare.

Il metodo di microiniezione lentivirale permette la visualizzazione dell'assone di singole cellule, delle morfologie dei neuroni sensoriali olfattivi e consente studi che manipolano l'espressione genica; la trasduzione lentivirale determina l'integrazione genetica stabile dei costrutti. Il lentivirus non infetta sinapticamente le cellule adiacenti. La visualizzazione può essere ottenuta già in tre giorni e si è dimostrata duratura per almeno tre mesi, probabilmente persistendo per periodi ancora più lunghi.

I neuroni sensoriali olfattivi non vengono facilmente infettati mediante infusione nasale di soluzione lentivirale. Pertanto, in questa procedura è necessaria una microiniezione attraverso la superficie. Questa è dunque la nostra procedura di microiniezione con lentivirus.

Spero che tu abbia trovato utile tutte queste informazioni per ottenere morfologie cellulari singole. Buona fortuna nella tua ricerca.