Name: Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Scopri la manipolazione genetica con lentivirus per visualizzare neuroni sensoriali olfattivi singoli in vivo. Questa tecnica permette di studiare le morfologie assonali e le arborizzazioni terminali nel sistema olfattivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo studio è sostenuto da NIH DC052256 e DC006015, e NSF 0.324.769 di QG e T32-DC008072 a BS.

1. Preparazione Questa procedura è biosicurezza di livello 2, quindi tutti i preparativi sono apportate le seguenti in una cappa rischio biologico in cui si svolge la procedura di microiniezione. <ol><li> Preparare e preriscaldare a 37 ° C ad acqua: Riempire un sacchetto di plastica con acqua di stoccaggio - tenuta e impostare su un svuotato riscaldamento blocco incubatore. Questo permetterà di recuperare i topi dopo l&#39;iniezione. </li><li> Riempire un contenitore di rischio biologico dei rifiuti con il 10% di candeggina per un volume adatto per immersione di tutti i rifiuti da questa procedura. </li><li> Preparare un piatto piccolo aperto di etanolo al 70% e un secondo piatto con ddH2O sterilizzato e posto nella cabina di sicurezza biologica. </li><li> Sterilizzare una siringa 5μL capacità di Hamilton con una 33-gauge a spruzzo discendono lungo il corpo ago con etanolo al 70% con lo stantuffo tirato fuori tutta la strada. Ripetutamente aspirare etanolo dal piatto ed espellere tutta la strada fuori almeno 5 volte. </li><li> Lavare la cartuccia siringa aspirando e espellendo acqua sterile almeno 5 volte. Luogo siringa in modo sicuro da parte nel cofano della cultura e lasciarlo asciugare. </li><li> Rimuovere le scorte virale da -80 ° C e magazzini frigoriferi, posto sul ghiaccio per consentire lo scongelamento. Microiniezione richiede 2μL di azioni virali per il mouse ad un titolo di 10 9 unità infettive / mL. Lentivirus possono essere ottenute da fonti commerciali o prodotte in laboratorio secondo il protocollo stabilito (Lois et al., 2002). </li><li> Preparare una fase di iniezione che prevede una zona rialzata rispetto la superficie del cofano - può utilizzare una capsula di Petri 10 centimetri coperta con un foglio di Kimwipe. </li><li> Disporre cotone imbevuto di alcol nei pressi della stazione di iniezione. </li></ol> 2. Microiniezione di particelle lentivirali nell&#39;epitelio olfattivo Tutte le procedure di animali effettuati in questo metodo sono fatto in base alle linee guida approvate IACUC. Il Mus musculus ceppo C57BL/6J è il modello animale utilizzato in tutti gli esperimenti hanno dimostrato qui. <ol><li> Anestetizzare cuccioli di topo da ipotermia prendendo un topo cucciolo (P0-P3) fuori dalla gabbia e mettendo il cucciolo su un taglio aperto guanto in ghiaccio per 5 minuti. </li><li> In attesa che il cucciolo di essere completamente anestetizzato, 2μL aspirato di magazzino virale nella siringa sterilizzata Hamilton. </li><li> Posizionare il mouse cucciolo in cima alla fase di iniezione. Tirare delicatamente la pelle dalla parte superiore della testa all&#39;orecchio verso la parte superiore del collo. Questo dovrebbe fornire una superficie cutanea insegnato nel corso della cavità nasale e la facilità di iniezione. </li><li> Inserire l&#39;ago attraverso la parte superiore della cavità nasale circa 3 mm sotto la superficie della pelle per raggiungere l&#39;epitelio olfattivo. Microinject 0.5μL di soluzione antivirus per colpo, la scelta di due siti per lato, sinistro e destro (quattro iniezioni totale per il mouse = 2μL di virus necessaria). Siti di iniezione devono essere sfalsati l&#39;uno dall&#39;altro. Per il targeting dei siti d&#39;iniezione appropriate, cercare la superficie dorsale del cranio per il contorno del bulbo olfattivo. Questa linea è appena visibile alla nascita attraverso la semi-trasparente la pelle e il cranio. Per fare due iniezioni per lato, mirano solo una iniezione rostrale ad una lampadina a delineare un asse mediale. Effettuare l&#39;inserimento seconda laterale alla struttura lampadina, ma assicurarsi di angolo l&#39;iniezione medialmente in modo che si può raggiungere l&#39;epitelio olfattivo che si trova ventralmente sotto il bulbo. Evitare di penetrare il bulbo olfattivo! </li><li> Asciugare qualsiasi soluzione residua virus o del sangue che possono sfuggire dal sito di iniezione o aperture con una narice Kimwipe. Disporre immediatamente di Kimwipes nel contenitore candeggina diluita rischio biologico. </li><li> Posizionare il mouse iniettato sul letto ad acqua incubatrice. </li><li> Ripetere i passaggi 1-4 per tutti i mouse da iniettare, ricordando che avrà bisogno di circa 2μL di azioni virali per il mouse. </li><li> Lasciate che i topi recuperare sulle incubatore letto ad acqua per 30 minuti prima di tornare al loro gabbia originale nidificazione. </li><li> Smaltire fase microiniezione, salviette igienizzanti e prodotti di carta qualsiasi ulteriore pulizia nello smaltimento candeggina rischio biologico. </li><li> Pulire la siringa Hamilton da ripetuti aspirazione ed espulsione di etanolo e acqua come fatto nelle fasi di preparazione. Lasciare la siringa ad asciugare. </li><li> Per la massima efficienza di trasduzione ripetere questa procedura di nuovo in 4 ore. OSNs infetto può essere visualizzato per tutta la lunghezza della cellula in meno di tre giorni. </li></ol> 3. Immunoistochimica di galleggianti sezioni bulbo olfattivo <ol><li> Sacrificare il mouse iniettati nel punto in tempo desiderato e perfusione fissare il tessuto con il 4% paraformaldeide. Sezionare la OB. Incubare in paraformaldeide notte e il 30% di saccarosio in PBS durante la notte. Incorporare nel mezzo di inclusione ottobre in ghiaccio secco. </li><li> Coronale sezioni OB si ottengono con una 60μm di spessore utilizzando un criostato. Sweep sezioni lampadina in un piatto di 10 centimetri cultura con 5 ml 1x PBS (pH 7,4). Sezioni devono essere tenuti galleggianti in PBS per consentire ottobre a dissolve. Trasferimento sezioni galleggianti e PBS in una fiala 50mL conica. </li><li> Consentono di fare tappe di depositarsi sul fondo della fiala. Aspirare PBS senza succhiare tutte le sezioni. Sciacquare sezioni di tessuto con 20 mL di PBS. Ripetere regolare e passi l&#39;aspirapolvere. Tessuto Risospendere con 10 ml di PBS e sezioni trasferimento galleggianti in una fiala da 15 ml conica per immunocolorazione. Una volta sezioni di tessuto si sono stabiliti, aspirare PBS surnatante senza disturbare i tessuti. Sezioni Risospendere con 0,3% Triton X-100 in 1x PBS, pH 7,4 (PBS-Tx) che consente detergente per perforare le membrane cellulari. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e ripetere l&#39;incubazione con PBS-Tx due volte. </li><li> Incubare sezioni di tessuto in 10 ml di soluzione bloccante (siero di cavallo al 5% in PBS-Tx) per due ore a temperatura ambiente. </li><li> Soluzione di risciacquo bloccare almeno due volte con PBS-Tx per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 2 ml di una soluzione di anticorpo primario in PBS-Tx. Reagenti e vedere sezione Attrezzature per gli anticorpi utilizzati in questo esperimento. </li><li> Sostituire il secondo PBS-Tx lavare il blocco con una soluzione di anticorpo primario. Incubare su una piattaforma lentamente a dondolo (~ 30rpm) a 4 ° C per 24-48 ore per permettere una buona penetrazione nelle sezioni 60μm galleggiante. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, la soluzione di anticorpo primario può essere recuperata con attenzione con una pipetta e conservato a 4 ° C per il riutilizzo fino a due volte nel giro di due settimane senza una significativa perdita di intensità della colorazione. </li><li> Lavare le sezioni per tre volte in PBS-Tx per 20 minuti ciascuno a temperatura ambiente con rotazione dolce (~ 30rpm). </li><li> Preparare 2 ml di diluizione anticorpo secondario in PBS-Tx. Aspirare l&#39;ultimo lavaggio e aggiungere la soluzione secondaria di anticorpi a sezioni di tessuto. Avvolgere la parte esterna della fiala colorazione foglio d&#39;alluminio per bloccare la luce, che può causare photobleaching fluoroforo. Luogo avvolto flaconcino su una piattaforma lentamente a dondolo e incubare a 4 ° C durante la notte. </li><li> Scartare la soluzione secondaria di anticorpi con un aspirapolvere distanza. Lavare le sezioni una volta con PBS-Tx per 20 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare altre due volte con PBS (pH 7,4) per 20 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Montare le sezioni di tessuto su vetrini colorati con Fluoromount G. </li><li> Schermo attraverso sezioni colorate per gli assoni OSN positivamente infetti e termini assone con un microscopio a fluorescenza. </li><li> Per costruire una vista tridimensionale di un marcato OSN assone e terminale pergolato, effettuare una serie di sezioni ottiche attraverso la profondità 60μm della porzione obiettivo tessuto OB (lungo l&#39;asse z) usando la microscopia confocale. </li><li> Questa pila di Z-sezione immagini possono poi essere proiettate insieme per ricostruire una prospettiva a 360 ° di rotazione di una singola etichetta OSN assone, tra cui dettaglio terminale pergolato nella sua interezza. Uno qualsiasi angolo di rotazione singoli possono essere catturati ed esportati come file immagine (es. JPG, TIFF) per la presentazione in formato 2D. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Con i metodi descritti qui, siamo in grado di trasdurre neuroni sensoriali olfattivi da lentivirus in vivo. Abbiamo così lontano OSNs visualizzati infettati con GFP e reporter mCherry fluorescenti, e con un myc-tag proteina di fusione mediante immunocitochimica. Questa tecnica offre una grande varietà di OSNs infetti. Eppure, trasduzione avviene sporadicamente abbastanza per fornire OSNs etichettate singolarmente, consentendo così l&#39;analisi della morfologia delle cellule singole. Assoni e dei terminali degli assoni sono esposte all&#39;interno di sezioni di tessuto OB in mezzo ai loro ambiente nativo di microscopia confocale (Figura 1). L&#39;intero OSN assone terminale pergolato in genere può essere catturato all&#39;interno di un 40-50 micron sezione ottica. Alto ingrandimento infetti terminali degli assoni OSN consente un&#39;analisi dettagliata dei assonale morfologia pergolato a livello glomerulare. <img src="/files/ftp_upload/2951/2951fig1.jpg" /> Figura 1. Traiettoria del singolo neurone olfattivo sensoriale assonale e il suo terminale pergolato. A) una sezione coronale del bulbo olfattivo di un mouse P7 che mostra il livello del nervo olfattivo (ONL) immunostained per OMP (rosso) e lo strato glomerulare (GL) immunostained sia con OMP e Vglut2 (grigio). Un singolo assone dei neuroni sensoriali olfattivi che esprimono GFP (verde) viaggia all&#39;interno della ONL e penetra nella struttura glomerulare. B) L&#39;assone terminale morfologia pergolato all&#39;interno del glomerulo chiaramente evidenziato dalla espressione di GFP. Vglut2 co-colorazione in grigio illumina la superficie totale glomular entro il quale la GFP-positive assone elabora un ABOR terminale. C) lentivirali OSNs infetti che esprimono GFP (verde) in OE. Il cytostructure dell&#39;epitelio olfattivo è mostrato con colorazione DAPI (blu). Espressione GFP permette la visualizzazione di corpi cellulari OSN e il loro processi cellulari in OE. D) Un assone OSN e la sua morfologia terminale con Rap1GAP2 espressione knock-down di shRNA. Lentivirus portando una cassetta a doppia espressione con Rap1GAP2 shRNA sotto il promotore del mouse U6 e GFP sotto unPromotore CMV sono stati applicati alla OE. Infetti terminali degli assoni olfattivi mostrato una più semplice terminale pergolato rispetto a quella del controllo GFP solo. Bar = 20μm.

<ol><li>Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+ablation+of+mature+olfactory+sensory+neurons+mediated+by+diphtheria+toxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor.</a> J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).</li>
<li>Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+epithelium+and+olfactory+bulb%3A+a+long-term+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Otol+Rhinol+Laryngol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study.</a> Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295, 868-872 (2002).</li>
<li>Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-mediated+gene+transfer+in+olfactory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo.</a> J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).</li>
</ol>

Questo protocollo è di biosicurezza di livello 2 compliant. Tutti di lavoro appropriati, protezione personale, e virali misure di contenimento dei rifiuti sono stati stabiliti di conseguenza. Tutte le procedure di animali sono stati eseguiti secondo le linee guida IACUC.

Microiniezione di risultati lentivirus in trasferimento definitivo di costrutti del gene nel DNA genomico OSN. Questo approccio ci permette di eseguire manipolazioni a breve termine oa lungo termine di geni candidati attraverso l&#39;iperespressione o mediata shRNA knock-down. Inoltre, siamo in grado di fluorescenza etichetta OSNs singolo in una linea esistente topo transgenico per osservare co-localizzazione delle popolazioni di recettore olfattivo. Microiniezione è necessaria per la trasduzione lentivirale di OSNs. Ab...

Microiniezione: topi appena nati sono stati microiniettati 5μL utilizzando una siringa Hamilton (Hamilton # 7647-01) con ago 33 gauge (Hamilton # 7762-06). Reagenti Immunocitochimica: anticorpi primari: GFP anticorpi policlonali di coniglio (Molecular Probes # A-6455), anticorpi policlonali contro pollo OMP (custom) (Chen et al, 2005.), Maiale d&#39;India anticorpi policlonali contro VGlut2 (Millipore # AB2251). Anticorpi secondari: Cy2 coniugato asino anti-coniglio (Jackson Immunolab # 711-225-152), Cy3-coniugati asino anti-pollo (Jackson Immunolab # 703-165-155) e Cy5-capra coniugato anti-cavia (Jackson Immunolab # 106-175-008). Le sezioni sono state montate su vetrini con Fluoromount G (Southern Biotech # 0010-01) con la soluzione 50ng/mL DAPI cromatina macchia. Confocale Imaging: Z-stack immagini sono state scattate con una Olympus Flouview FV1000 microscopio confocale e le immagini raccolte e trasformate in proiezioni in 3D utilizzando Olympus FV10-ASW acquisizione confocale 2.01 e software di analisi.

lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi in vivo</em

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Sviluppo di un circuito preciso olfattivo si basa sulla proiezione accurata dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) assoni ai loro bersagli sinaptici nel bulbo olfattivo (OB). I meccanismi molecolari della crescita degli assoni OSN e targeting non sono ben compresi. L&#39;espressione genica e la successiva manipolazione di visualizzazione degli assoni OSN singoli e la loro morfologia terminale pergolato finora sono stati difficili. Per studiare la funzione dei geni a livello di singola cellula all&#39;interno di un periodo di tempo specificato, abbiamo sviluppato una tecnica basata lentivirale per manipolare l&#39;espressione genica in OSNs in vivo. Particelle lentivirali sono consegnati a OSNs dalla microiniezione nell&#39;epitelio olfattivo (OE). Cassette di espressione sono poi definitivamente integrata nel genoma di OSNs trasdotte. Espressione della proteina fluorescente verde identifica OSNs infetti e delinea la loro morfologia, inclusi il terminale assone pergolato. A causa del tempo di risposta brevi tra microiniezione e la rilevazione giornalista, studi di funzione del gene può essere concentrato in un periodo molto ristretto di sviluppo. Con questo metodo, abbiamo rilevato espressione GFP all&#39;interno da un minimo di tre giorni e fino a tre mesi dopo l&#39;iniezione. Abbiamo raggiunto entrambi over-espressione e shRNA mediata knock-down da microiniezione lentivirali. Questo metodo fornisce morfologie dettagliate di corpi cellulari OSN e assoni a livello di singola cellula in vivo, e permette quindi la caratterizzazione della funzione del gene candidato durante lo sviluppo olfattivo.

Vi presentiamo una tecnica lentivirali per la manipolazione genetica e la visualizzazione di singoli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi e la sua arborizzazione terminale<em&gt; In vivo</em&gt;.

Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo</em

Lo sviluppo di un circuito olfattivo preciso dipende dalla proiezione accurata degli assoni dei neuroni sensoriali olfattivi (OSN) verso i loro target sinaptici nel...

Una delle sfide nello studio dello sviluppo nelle neuroscienze è catturare le morfologie dendritiche e assonali a livello di singola cellula in vivo. Nel sistema olfattivo, i neuroni sensoriali olfattivi estendono i loro assoni dall'epitelio olfattivo nel naso fino al bulbo olfattivo nel cervello. Poiché numerosi neuroni sensoriali olfattivi si proiettano verso il bulbo olfattivo, si raggruppano in fasci.Questo complica lo studio delle traiettorie individuali degli assoni e delle loro morfologie terminali. Abbiamo sviluppato un metodo per visualizzare singoli neuroni sensoriali olfattivi in vivo mediante microiniezione di un costrutto GFP portatore di lentivirus.Una trasduzione riuscita con lentivirus illumina l'intera lunghezza dell'assone del neurone sensoriale olfattivo, inclusa l'arborizzazione terminale. Oltre alla visualizzazione di singoli neuroni sensoriali olfattivi, questo metodo ci consente di manipolare l'espressione genica di un particolare gene di interesse per studiarne la funzione in un contesto in vivo. Questa procedura con lentivirus richiede un livello di sicurezza biologica due e deve essere eseguita all'interno di una cappa a flusso laminare.Per mantenere un ambiente sterile, spruzzare con etanolo al 70% tutti gli oggetti inseriti nell'incubatore, preparare e preriscaldare un lettino riscaldato a 37 gradi per almeno 20 minuti prima dell'iniezione. Sigillare un sacchetto di plastica riempito a metà con acqua e posizionarlo su un blocco riscaldante vuoto dell'incubatore.Questo permetterà ai topi di riprendersi dopo l'iniezione. Riempire un contenitore per rifiuti biologici con una soluzione al 10% di candeggina per decontaminare tutti i materiali esposti al virus. A partire da questa procedura, preparare una piccola capsula aperta contenente etanolo al 70% e una seconda capsula con acqua distillata sterile.In una cappa a flusso laminare, utilizzeremo una siringa Hamilton da cinque microlitri con un ago da 33 gauge. Questo modello specifico consente di regolare la resistenza del pistone ruotando una manopola di tensione situata nella parte superiore della camera del pistone. Questa caratteristica permette il controllo del volume di microiniezione e la sterilizzazione dell'ago e della camera della siringa.Aspirare ed espellere ripetutamente l'etanolo dalla piastra diverse volte. Sciacquare la cartuccia della siringa aspirando ed espellendo acqua sterile diverse volte. Mettere la siringa in un luogo sicuro all'interno della cappa a flusso laminare.Posizionare salviette alcoliche vicino alla stazione di iniezione. Preparare una piattaforma per iniezioni che offra una superficie rialzata per facilitare il posizionamento del topo. È possibile utilizzare una piastra di coltura da 10 centimetri capovolta, ricoperta con salviette Kim.I cuccioli di topo possono essere anestetizzati mediante ipotermia fino all'età断 weaning. Ritagliare un dito da un guanto di gomma e inserire il cucciolo di topo nel ritaglio del dito. Successivamente, posizionare sul ghiaccio per cinque minuti.Il guanto eviterà scottature cutanee che potrebbero verificarsi a causa del contatto diretto della pelle con il test del ghiaccio per verificare un’anestesia completa, pizzicando le zampe posteriori e anteriori del cucciolo per assicurarsi che l’animale non reagisca. Ora siamo pronti per la microiniezione del lentivirus. Illustreremo la procedura utilizzando un cucciolo neonato.Se si utilizza un topo di et&agrave; pi&ugrave; avanzata, si dovrebbe sostituire l'ago da 33 gauge con un ago di gauge pi&ugrave; spesso per poter penetrare la superficie del cranio. Sterilizzare la superficie del naso del topo passandovi un batuffolo di alcol. Rimuovere le scorte di lentivirus dal congelatore e scongelarle sul ghiaccio.Abbiamo prodotto lentivirus in laboratorio seguendo metodi consolidati. Nello sviluppo di questo metodo, abbiamo riscontrato che è necessaria una titolazione virale minima di 10 alla nona unità infettive per millilitro per ottenere un buon tasso di trasduzione. Aspirare due microlitri di soluzione stock di lentivirus nella siringa sterile di Hamilton.Posizionare il topo neonato sulla piattaforma di iniezione. Afferrare la pelle sulla sommità della testa a livello delle orecchie e tirare delicatamente all'indietro. Abbiamo dotato il nostro armadio a flusso laminare di un microscopio stereoscopico.Per indirizzare con precisione le microiniezioni, cercare sulla superficie dorsale del cranio, a livello del proencefalo, il profilo del bulbo olfattivo. I nostri bersagli per le microiniezioni circondano strettamente il bulbo olfattivo, ma non devono includere il bulbo stesso. Effettuiamo quattro iniezioni nell'epitelio olfattivo di ogni cucciolo.Queste posizioni, indicate con puntini blu, richiedono che l'ago venga inserito con un angolo orientato medialmente. Le due iniezioni aggiuntive, indicate con puntini verdi, sono sfalsate, più medialmente e anteriormente rispetto al bulbo olfattivo. Queste iniezioni possono essere eseguite con un angolo leggermente obliquo.Le raccomandazioni relative all'angolazione dell'ago tengono conto della posizione ventrale dell'epitelio olfattivo, che si trova principalmente al di sotto del bulbo olfattivo. L'accesso perpendicolare è pertanto limitato. Inserire l'ago attraverso la parte superiore della cavità nasale, circa tre millimetri al di sotto della superficie della pelle.Per raggiungere l'epitelio olfattivo. Una mano esperta dovrebbe percepire la diminuzione della resistenza quando si raggiunge lo spazio luminale della cavità nasale. Quest'area deve essere evitata.Microiniettare 0,5 microlitri di soluzione virale per posizione. Ancora una volta, scegliendo due siti per lato, sia a sinistra che a destra, per un totale di quattro iniezioni di 0,5 microlitri. Ciascuna per topo significa due microlitri di virus necessari per topo in una singola sessione di iniezione.Anche in questo caso, fare attenzione a non iniettare nel bulbo olfattivo residui di soluzione virale o sangue che potrebbero fuoriuscire dal sito di iniezione o dalle aperture nasali. Utilizzando un panno imbevuto di etanolo, smaltire i tamponi nel contenitore con soluzione di candeggina diluita e posizionare immediatamente il topo iniettato nell'incubatrice ad acqua per il recupero. Decontaminare la siringa con ago ripetendo la procedura di sterilizzazione eseguita durante la preparazione. I topi iniettati possono essere rimessi nella gabbia 30 minuti dopo il recupero nell'incubatrice ad acqua.Questa intera microiniezione può essere ripetuta nuovamente dopo quattro ore. Se si desidera aumentare il numero di neuroni sensoriali olfattivi che verranno infettati, i neuroni sensoriali olfattivi infettati possono essere visualizzati lungo tutta la lunghezza della cellula già in soli tre giorni. Gli animali vengono sacrificati e perfusi per l'osservazione al momento desiderato.Utilizzando metodi standard per visualizzare le traiettorie dei neuroni sensoriali olfattivi transdotti a livello di singola cellula e i loro assoni terminali, si procede con la dissezione e il taglio del bulbo olfattivo in sezioni coronali di uno spessore di 60 micron. La sezione conterrà quindi tutti gli strati cellulari del bulbo olfattivo, inclusi i fasci di assoni dei neuroni sensoriali olfattivi e le terminazioni assoniche, che sinaptano in strutture glomerulari localizzate alla superficie del bulbo, in preparazione per l'immunohistochimica in sospensione. Si eseguono sezioni seriali del bulbo olfattivo, che vengono raccolte complessivamente in una piastra di coltura da 10 centimetri contenente cinque millilitri di soluzione salina fosfato tampone.Trasferire le sezioni galleggianti in un vial conico da 50 millilitri. Una volta che le sezioni si sono depositate sul fondo del vial, aspirare il tampone salino fosfato. Fare attenzione a non aspirare le sezioni.Si rinnovano i campioni aggiungendo 10 millilitri di tampone fresco per eliminare qualsiasi fissativo residuo o materiale di inclusione. Si pipetta immediatamente questa sospensione in un tubo conico da 15 millilitri, assicurandosi di recuperare tutti i campioni galleggianti, si aspira la soluzione di lavaggio e si permeabilizzano i campioni con una soluzione di Triton X-100 0,3% in soluzione salina fosfato, quindi si pone il tubo su un agitatore rotante per 10 minuti. A temperatura ambiente, si può quindi procedere con un protocollo standard di immunomarcatura nello stesso tubo conico, ripetendo le fasi di aspirazione e agitazione secondo necessità per questo tipo di contenitore, mantenendo un volume di 10 millilitri per le fasi di marcatura e lavaggio.Di seguito è riportato un elenco di anticorpi che utilizziamo per la colorazione congiunta di neuroni sensoriali olfattivi positivamente trasdotti e della popolazione generale di neuroni sensoriali olfattivi. Per garantire una penetrazione completa degli anticorpi nei tagli del bulbo di 60 micron, si raccomanda un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. Anche i lavaggi devono avere una durata non inferiore a 20 minuti ciascuno.Stendere delicatamente ciascuna sezione su un vetrino con un pennello, montando ogni vetrino con il Mount G per flora integrato con soluzione colorante per la cromatina. Prestare attenzione a eliminare tutte le bolle dal mezzo di montaggio. Montare le sezioni in file per semplificare il successivo passaggio di screening.Scansionare questi strati nei preparati di bulbo olfattivo colorati per immunomarcatura alla ricerca di fibre assonali e terminazioni positive per GFP. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, le terminazioni nervose positivamente infette possono quindi essere analizzate mediante microscopia confocale. È utile calibrare il piano focale nella zona di interesse utilizzando i canali DPI e della proteina marcatrice olfattiva.Questi risultati mostrano una singola fibra assonale e un terminale assonale di un neurone sensoriale olfattivo all'interno del glomerulo, che è colorato in rosso con la proteina marcatrice olfattiva (CO) e in grigio con vlu due. I corpi cellulari dei neuroni sensoriali olfattivi infettati e i loro bottoni dendritici possono essere visualizzati anche all'interno dell'epitelio olfattivo, qualora questo tessuto sia stato incluso nei passaggi di dissezione e immunomarcatura. La mia proiezione al microscopio confocale ci fornisce una morfologia estremamente dettagliata del percorso di estensione assonale e dell'arborizzazione terminale di un singolo neurone sensoriale olfattivo. È possibile osservare il ripiegamento della fibra assonale verso il suo bersaglio glomerulare, nonché i dettagli del suo modello di ramificazione all'interno della neuropila glomerulare.Il metodo di microiniezione lentivirale permette la visualizzazione dell'assone di singole cellule, delle morfologie dei neuroni sensoriali olfattivi e consente studi che manipolano l'espressione genica; la trasduzione lentivirale determina l'integrazione genetica stabile dei costrutti. Il lentivirus non infetta sinapticamente le cellule adiacenti. La visualizzazione può essere ottenuta già in tre giorni e si è dimostrata duratura per almeno tre mesi, probabilmente persistendo per periodi ancora più lunghi.I neuroni sensoriali olfattivi non vengono facilmente infettati mediante infusione nasale di soluzione lentivirale. Pertanto, in questa procedura è necessaria una microiniezione attraverso la superficie. Questa è dunque la nostra procedura di microiniezione con lentivirus.Spero che tu abbia trovato utile tutte queste informazioni per ottenere morfologie cellulari singole. Buona fortuna nella tua ricerca.

lentivirus-mediated-genetic-manipulation-visualization-olfactory

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

La risoluzione temporale e spaziale di manipolazioni genetiche determina lo spettro di fenomeni biologici che possono turbare. Qui usiamo temporalmente e spazialmente...

Targeting neuroni bulbo olfattivo utilizzo combinato In Vivo Elettroporazione e GAL4-Based Enhancer Trappola Linee Zebrafish

I neuroni adulti, nato del bulbo olfattivo può essere controllato tramite optogenetically Channelrhodopsin2 che esprimono iniezione lentivirali nel flusso migratorio rostrale e fotostimolazione cronica con una miniatura impiantato LED.

Selettiva trasduzione virale di neuroni olfattivi per adulti nati per cronica In vivo Optogenetic Stimolazione

Fonte: Kozin, E. D., et.al. Visualizzazione diretta del nucleo cocleare dorsale murino per la stimolazione optogenetica della via uditiva. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra il trasferimento genico mediato da virus nel nucleo cocleare dorsale del topo (DCN) per consentire la stimolazione uditiva indotta dalla luce. Un vettore virale che codifica per l'opsina, un canale ionico sensibile alla luce, viene iniettato nel DCN dopo una craniotomia e un'aspirazione cerebellare per l'accesso diretto.

Trasferimento genico mediato da virus nel nucleo cocleare dorsale del topo per la stimolazione uditiva indotta dalla luce

Vettori virali per consentire la manipolazione genica mirata. Abbiamo dimostrato un metodo per l'espressione genica condizionale o ablazione nel midollo spinale topo, utilizzando iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale, un luogo di rilievo di contatto sinaptico tra afferenze somatosensoriali primarie e neuroni del sistema nervoso centrale.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Descriviamo un protocollo per la marcatura in vivo dei neuroni sensoriali olfattivi mediante elettroporazione e successiva scansione laser confocale o microscopia multifotone per visualizzare la morfologia neuronale e il suo sviluppo nel tempo.

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia In Vivo

Qui descriviamo una procedura basata sull'uso di particelle lentivirali per la modificazione genetica a lungo termine delle cellule staminali neurali e/o delle loro cellule ependimali adiacenti nella nicchia neurogenica ventricolare-subventricolare adulta che consente l'analisi separata degli effetti autonomi e non autonomi delle cellule staminali neurali.

Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per l&#39;analisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi

L'iniezione intraspinal di recombinase dipendente ricombinanti virus adeno-associato (rAAV) può essere utilizzato per manipolare qualsiasi tipo di cellula geneticamente etichettati nel midollo spinale. Qui descriviamo come trasduce neuroni nel corno dorsale del midollo spinale lombare. Questa tecnica consente funzionale interrogatorio del sottotipo del neurone manipolati.

Espressione del Transgene di mediata da Virus adeno-associato in neuroni geneticamente definiti del midollo spinale

L'attuale protocollo dimostra un metodo semplice per tracciare le proiezioni del glutammato dell'area tegmentale ventrale (VTA) all'ippocampo. La fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA è stata combinata con la registrazione CA1 per dimostrare come i terminali del glutammato VTA modulano la presunta velocità di attivazione piramidale di CA1 in vivo.

Tracciato anatomico e funzionale combinato in vivo dei terminali del glutammato dell'area tegmentale ventrale nell'ippocampo

Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Descriviamo qui i metodi per indurre e analizzare il rimodellamento olfattivo dipendente dall'esperienza dei glomeruli sinaptici del lobo antennale nel cervello giovanile di Drosophila .

Rimodellamento dipendente dall'esperienza del cervello giovanile, neurone sensoriale olfattivo, connettività sinaptica in un periodo critico della prima infanzia

Scopri la manipolazione genetica con lentivirus per visualizzare neuroni sensoriali olfattivi singoli in vivo. Questa tecnica permette di studiare le morfologie assonali e le arborizzazioni terminali nel sistema olfattivo.

Lentivirus-mediata manipolazione genetica e la visualizzazione dei neuroni sensoriali olfattivi In vivo

Esplora altri video