Preparazione di adulti Drosophila Occhi di sezionamento sottile e analisi microscopica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare gli occhi adulti di drosofila per il sezionamento sottile, consentendo la valutazione dettagliata dei fenotipi oculari mutanti, come i difetti di polarità delle cellule planari. Ciò si ottiene tagliando prima le teste delle mosche anestetizzate. Il tessuto oculare viene quindi fissato e incorporato in una resina epossidica.

Una volta che la resina si è solidificata, gli occhi incorporati vengono tagliati. Per il sezionamento, il passaggio finale consiste nel sezionare sottilmente gli occhi utilizzando un microtomo dotato di un coltello diamantato. In definitiva, l'analisi della sezione oculare consentirà la caratterizzazione dei fenotipi oculari di nuovi mutanti o la quantificazione delle interazioni genetiche tra geni di una via di segnalazione, come la via PCP.

Entrambi aiuteranno a caratterizzare il ruolo fisiologico di geni di nuova identificazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della drosofila, come ad esempio il modo in cui le nuove mutazioni influenzano lo sviluppo dell'occhio o il modo in cui i geni interagiscono nei saggi di interazione genetica. Diverse fasi della procedura di inclusione degli occhi, come l'allineamento degli occhi negli stampi di sezionamento sono molto più facili da capire, che in realtà piuttosto che in forma di testo Per iniziare indossare un paio di guanti in preparazione per la fissazione delle teste di mosca e glutaraldeide e osmio, entrambi sostanze chimiche tossiche.

Quindi anestetizzare le mosche usando CO2 e picchiettarle su un cuscinetto per mosche protetto da carta watman sotto un microscopio da dissezione, in genere separare sei mosche più una mosca aggiuntiva per garantire che sei teste di mosca incorporate per genotipo tengano e premere delicatamente il torace della mosca con una pinzetta e quindi rimuovere la testa della mosca usando un bisturi, Stabilizzare la testa della mosca toccando il collo con le pinzette e tagliare con cura una piccola parte di un occhio per migliorare la penetrazione del fissativo. Toccare la testa con una pinzetta o il bisturi sulla superficie dell'occhio tagliato per trasferire la testa nel fissativo del fosfato di glutaraldeide su ghiaccio. Assicurati di indossare i guanti durante tutto il processo di fissaggio.

Per prima cosa etichettare tutti gli stampi per tenere traccia dei diversi genotipi. Quindi riempi ogni stampo con resina al 100% facendo attenzione a non riempirli eccessivamente. La parte superiore dovrebbe essere piatta su tutta la superficie.

Utilizzando una pipetta di trasferimento, rimuovere la resina al 50% dalle testine. Sostituire con resina al 100% e incubare per tre o quattro ore a temperatura ambiente. Man mano che le teste si equilibrano nella resina nel corso dell'incubazione, affonderanno sul fondo del tubo.

Colpisci uno stuzzicadenti su una superficie dura per creare un piccolo gancio. Usando questo strumento, trasferisci una singola testa di mosca in ogni stampo. Posizionare un foglio di alluminio sull'area di lavoro del microscopio da dissezione per proteggerlo dalla fuoriuscita di resina.

Con l'aiuto del cannocchiale da dissezione, utilizzare l'ago da dissezione per far roteare leggermente e con attenzione la testa. Spostalo sul fondo dello stampo, vicino all'estremità appuntita. Allineare con cura la superficie dell'occhio intatto con la parete anteriore dello stampo con il collo rivolto verso il basso.

Assicurati di mantenere la superficie tangenziale dell'occhio, a circa mezzo diametro della testa di distanza dalla parete dello stampo. Se gli occhi si muovono durante la rimozione dell'ago da dissezione, riposizionare gli occhi desiderati, ritrarre rapidamente l'ago leggermente lontano dalla testa, quindi rimuovere lentamente l'ago completamente. Una volta che tutte le teste sono state allineate, ricontrolla tutti gli occhi per assicurarti che non si siano mossi.

Quando hai rimosso l'ago dalla resina, se presente o hai riallineato la testa di traverso, trasferisci gli stampini in forno e cuocilo a 70 gradi per una notte. Dopo la cottura per una notte, rimuovere i blocchi induriti dagli stampini piegando gli stampi. Tieni traccia di quale blocco corrisponde a quale genotipo conservandoli in contenitori etichettati.

Per tagliare i blocchi, montare un blocco su un mandrino per microtomo, in modo che l'occhio sia rivolto verso l'alto sotto il cannocchiale di dissezione. Utilizzando una lama di rasoio rivestita in teflon, tagliare con cura solo lo strato superiore del blocco. Questo lascia una superficie chiara attraverso la quale l'occhio può essere visto e il piano di sezionamento può essere stabilito.

Quindi, taglia la plastica in eccesso su entrambi i lati della testa e sulla parte anteriore fino a quando la maggior parte della plastica intorno alla testa non viene tagliata. È meglio avvicinarsi lentamente alla testa tagliando più strati sottili di plastica usando una lama di rasoio pulita. Rimuovere con cura gli strati sottili dalla parte superiore dell'occhio nell'esatto piano di sezionamento desiderato.

Assicurati di utilizzare aree fresche della lama del rasoio per ogni taglio e continua fino a raggiungere la superficie esterna dell'occhio. Il blocco rifilato risultante sarà una piramide a tre lati con una parte superiore tagliata leggermente inclinata che corrisponde al piano di sezionamento. Montare il blocco nel microtomo e iniziare il sezionamento.

Fino a quando non sono state generate da 20 a 30 sezioni, le sezioni risultanti galleggeranno sulla superficie dell'acqua nel serbatoio. Posiziona un vetrino su una piastra riscaldante impostata a 100 gradi Celsius. Quindi sollevare il primo lotto di sezioni con un'estremità appiattita di un cotton fioc di legno da sotto la superficie dell'acqua con un movimento rotatorio, quindi trasferirle in una goccia d'acqua.

Sullo scivolo, attendere che l'acqua sia evaporata e che le sezioni siano attaccate allo scivolo, quindi ripetere con altre 20-30 sezioni. In genere, le sezioni di tre occhi posizionate in sei gocce d'acqua si adattano bene su uno scivolo. Una volta che tutte le sezioni sono state raccolte sul vetrino, possono essere colorate e montate per la microscopia in una sezione tangenziale attraverso l'occhio di una mosca occhio selvatico.

I TIA mostrano polarità normale e sono ben orientati rispetto alla linea ventrale dorsale di simmetria, che è illustrata da una linea gialla nello schema sottostante. In contrasto con il tia ben orientato dell'occhio di tipo selvatico qui in un occhio mutante dello strabismo, la polarità tiale è persa, e anche se è presente l'intero complemento fotorecettore, la rotazione e l'alità sono randomizzate. Inoltre, si noti l'assenza del pigmento del reticolo cellulare del pigmento e delle singole cellule fotorecettrici.

Poiché il mutante dello strabismo era in un background genetico bianco meno, la drosophila ro chinasi o goccia è una mutazione letale omozigote, che richiede quindi un'analisi clonale. Qui, i cloni mutanti Dr.Homozygous sono caratterizzati dall'assenza di pigmento e mostrano difetti di rotazione, nonché difetti strutturali, tra cui un numero mancante o eccessivo di cellule fotorecettrici a livello di singola cellula. Esempi di fotorecettori mutanti e wild type sono indicati rispettivamente da punte di freccia blu aperte o piene.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incorporare e sezionare gli occhi delle mosche. Entro circa tre giorni. Dovresti essere in grado di analizzare regolarmente i fenotipi oculari in dettaglio, consentendoti di affrontare la funzione di nuovi geni durante lo sviluppo dell'occhio.