Name: Preparazione di adulti Drosophila Occhi di sezionamento sottile e analisi microscopica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Impara a preparare occhi di Drosophila adulti per sezionamento sottile e analisi microscopica. Questo metodo consente di caratterizzare fenotipi mutanti e quantificare interazioni genetiche nello sviluppo oculare.

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Vorrei ringraziare il Dott. Jennifer Curtiss per la foto in fig. 1 e Jeremy Fagan e il Dr. Marlow Firenze per la lettura critica del manoscritto. Il nostro lavoro è supportato dal NIH concedere 1R01GM088202.

1. Vola dissezione testa <ol><li> Assicurarsi di avere tutti i materiali a portata di mano (compresi gelatina vetrini rivestiti). Preparare glutaraldeide e fissativi osmio (vedi sotto). Per genotipo di inserire, aliquota 200μl soluzione fissare glutaraldeide in provette da 1,5 ml su ghiaccio. </li><li> Anestetizzare vola sul CO 2 pad (che di solito sezionare sette teste volare a incorporare sei per genotipo nel caso in cui una testa è distrutto durante la procedura). </li><li> Attesa e premete leggermente il torace del lato volare, dorsale alto, con le pinzette e utilizzare un bisturi affilato per tagliare la testa. </li><li> Stabilizzare la testa vola toccando il collo con le pinzette e con attenzione fetta fuori una piccola parte di un occhio. Questo aumenta la penetrazione del fissativo (se si intende utilizzare le sezioni occhio per l'analisi clonale, tagliare l'occhio con cloni senza o meno). Evitare di toccare e di danneggiare l'occhio intatto, che sarà poi sezionato. </li><li> Toccare la testina con le pinzette o il bisturi sulla superficie del cut off e trasferimento occhio della testa in glutaraldeide / fosfato fissativo su ghiaccio (le teste spesso galleggiante sopra il fissativo) Le teste dissezionato non dovrebbero essere tenuti in glutaraldeide fissare più a lungo di 15 minuti prima l'aggiunta di osmio. Ripetere i passaggi 1,2-1,5 con le mosche che altri lo stesso genotipo. </li></ol> 2. Fissazione e di inclusione (utilizzo di guanti per tutte le fasi!) <ol><li> Gira la flyheads in centrifuga Eppendorf per 1 minuto a 10.000 giri. Continua anche se il capo non affondare. </li><li> Aggiungere 200μl di OsO 4 soluzione e fissare per almeno 30 minuti e fino a 1 ora su ghiaccio. </li><li> Utilizzando una pipetta Pasteur, rimuovere la glutaraldeide / osmio soluzione (assicurarsi di utilizzare le corrette procedure di smaltimento dei rifiuti!) E sostituirlo con una soluzione di osmio 200μl. Incubare in ghiaccio per 1-6 ore. Assicurarsi sempre le teste sono completamente ricoperto di liquido e mai rimuovere tutta la soluzione come la testa o gli occhi potrebbe crollare! </li><li> Utilizzando una pipetta Pasteur, scartare fissativo, aggiungere 0,5-1ml 30% etanolo e incubare per almeno 5 minuti in ghiaccio (assicurarsi di utilizzare correttamente le procedure di smaltimento dei rifiuti in quanto l'etanolo contiene ora osmio!). </li><li> Ripetere la stessa operazione con il 50%, 70%, (80%), il 90% e due volte di etanolo al 100%. Includere il passo etanolo all'80% se si utilizzano gli occhi per l'analisi al microscopio elettronico. Dopo la fase di lavaggio del 70%, i campioni possono essere rimossi dal ghiaccio. </li><li> Sostituire l'etanolo con un uguale volume di ossido di propilene (volatili, continuano a lavorare nel cappuccio). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Ripetere ossido di propilene lavare. Lavoro in batch in caso di trattamento genotipi in parallelo per evitare collasso degli occhi a causa dell'evaporazione di ossido di propilene. </li><li> Eliminare la maggior parte di ossido di propilene e l'utilizzo di una pipetta di plastica trasferimento, aggiungere circa 500μl di un 1:1 in resina: soluzione di ossido di propilene. Equilibrare la notte a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Incorporare e disposizione in stampi <ol><li> Assicurarsi che tutti gli stampi sono etichettati in modo da tenere traccia delle differenti genotipi, quindi riempire gli stampi con il 100% resina. Non riempire troppo (no 'alte colline' su tutta la superficie degli stampi, quando guardando dritto su tutta la superficie dello stampo). Usa resina dura per l'analisi EM. </li><li> Usando una pipetta di trasferimento, togliere la resina 50% dal teste, sostituire con il 100% di resina, e incubare per 3-4 ore a temperatura ambiente. Come teste sono infiltrati con la resina, essi si depositano sul fondo della provetta. </li><li> Utilizzando uno stuzzicadenti che è stato colpito su una superficie dura, una volta per creare un gancetto, una testa di trasferimento al momento in uno stampo. </li><li> Posizionare un foglio di alluminio sulla zona di lavoro della vostra portata dissezione per la protezione contro le fuoriuscite di resina. </li><li> Utilizzando un ago da dissezione e guardando se il vostro scopo, agitare la testa leggermente nella resina e con attenzione si sposta verso il fondo dello stampo vicino l'estremità appuntita. </li><li> Allineare con cura la superficie del intatta (!) Occhio (o il vostro aereo future sezionamento se si vuole avere sezioni) collo in giù con la parete frontale dello stampo, avendo cura di mantenere la superficie tangenziale dell'occhio circa la metà a testa diametro di distanza dalla parete dello stampo. In rari casi, un occhio che crolla può essere visto come uno spazio vuoto tra la superficie dell'occhio e la cuticola testa. Se avete un occhio crollato, sostituirlo con l'occhio 7 ° di ricambio. </li><li> Ripetere con tutte le teste. Una volta fatto con tutti i tracciati, ricontrollare tutti gli occhi per assicurarsi che non si muove quando è stato rimosso l'ago della resina. </li><li> Se avete problemi con occhi che si muovono quando si rimuove l'ago dissezione, posizionare l'occhio come desiderato, in modo rapido ritrarre l'ago un po 'lontano dalla testa e si estrae quindi lentamente l'ago completamente. </li><li> Cuocere gli stampi durante la notte a 70 ° C. </li></ol> 4. Rifilatura e di sezionamento <ol><li> Rimuovere i blocchi indurito dagli stampi piegando gli stampi, keeping traccia di quale blocco corrisponde a quale genotipo (ad esempio, memorizzare in fiale di scintillazione di piccole dimensioni). </li><li> Per il taglio, utilizzare un mandrino appropriato per il microtomo che è montato a faccia in su un blocco di plexiglas o alluminio. Montare il blocco di tagliare, gli occhi in su, nel mandrino. </li><li> Nell'ambito di applicazione dissezione con un rasoio rivestiti in Teflon ordinò, accuratamente tagliato fuori solo lo strato superiore del blocco. Questo lascerà una superficie trasparente attraverso la quale si dovrebbe vedere l'occhio e può quindi prevedere il piano futuro di sezionamento. Evitare di tagliare le dita! </li><li> Tagliare l'eccesso di plastica su entrambi i lati della testa e sulla parte anteriore (cioè quella che era la parte superiore dello stampo quando si allinea gli occhi) finché la maggior parte della plastica intorno alla testa è tagliata. E 'meglio per avvicinarsi lentamente alla testa da tagliare più sottili strati di plastica. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio pulito, rimuovere con attenzione strati sottili dalla parte superiore dell'occhio nel piano esatto volete sezione successiva (di solito tangenzialmente ad occhio, con una leggera angolazione verso la superficie dello stampo originale). </li><li> Continuare fino a poco iniziano a tagliare la superficie esterna dell'occhio. Assicurarsi di utilizzare aree pulite della lama per ottenere una superficie lucida e trasparente, che rende più facile allineamento nel microtomo. </li><li> Per risparmiare sulle lame di rasoio, usare vecchie lame per il taglio greggio intorno ai lati del blocco e l'uso di una lama fresca per il taglio sottile (primo taglio e 4.6). Alla fine si avrà una piramide su tre lati con un po 'inclinato, cut-off superiore che corrisponde al piano di sezione futuro. </li><li> Montare il blocco nel microtomo. Sezionamento effettiva varia a seconda del tipo di microtomo e non saranno descritte in dettaglio qui. Usiamo un Sorvall MT5000 con un coltello di diamante di qualità isto di tagliare 0,5 a 1μm sezioni. Per la luce analisi al microscopio, lievi variazioni di spessore sezione non importa. Se cloni sezionamento segnato da un bianco + transgene, sezione 1μm sezioni per assicurare di avere granuli di pigmento abbastanza adiacente alla rhabdomeres per sezione (Fig. 2). </li><li> Sezioni galleggia sull'acqua. Sollevare primi 20-30 sezioni con una punta schiacciata di legno Q-tip da sotto la superficie dell'acqua in un movimento di rotazione e trasferirli in una goccia d'acqua su un vetrino da gelatina vetro rivestito (tenuto su una piastra di riscaldamento a circa 100 ° C ). </li><li> Ripetere con altri 20-30 sezioni. Attendere fino a quando l'acqua è evaporata e sezioni bastone alla diapositiva. Di solito, le sezioni di 3 occhi disposti in tre colonne (tre occhi) da filari twp (alto / basso sezioni) si adattano bene su una diapositiva. </li></ol> 5. Colorazione e analisi al microscopio <ol><li> A meno che cloni di sezionamento, sezioni macchia. Porre il vetrino con sezioni su un blocco di riscaldamento a 90 ° C. Dispensare toluidina-blu soluzione colorante da una siringa da 30 ml collegata ad un filtro 0.22μm sul vetrino e macchia per 10 secondi. Sciacquare immediatamente a lungo con acqua distillata. Asciugare all'aria. </li><li> Utilizzando una pipetta di plastica trasferire, distribuire 3 gocce di DPX montaggio medio sul vetrino e coprire con un coprioggetto. Top con 3 monetine e lasciare che il montaggio di media indurire (per esempio durante la notte a temperatura ambiente). </li><li> Immagine con un microscopio ottico. Utilizzare una lente 5x o 10x per trovare una buona sezione e quindi passare a una lente 63x immersione in olio per l'analisi dettagliata e fotografare. Noi di solito utilizzare le impostazioni di contrasto di fase, campo scuro ma l'ottica funziona altrettanto bene. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Il più delle volte, gli occhi sono incorporate in plastica per una dettagliata analisi dei fenotipi esterno dell'occhio rough rilevato come parte di uno screening genetico o in fase di test interazioni genetiche con geni noti per influenzare sia la struttura generale degli occhi o polarità. Risultati tipici di sezioni occhio sono mostrati in Figura 3. Wild-type ommatidi (Fig. 3A) mostrano la serie completa dei fotorecettori circondata da un reticolo di cellule del pigmento. Al contrario, in un strabismo (stbm, alias van gogh-7) mutante, la polarità ommatidial si perde e, anche se il complemento fotorecettore completo è presente, la rotazione e la chiralità sono randomizzati (Fig. 3B). Inoltre, poiché l'allele stbm è stato sezionato in aw - sfondo, i granuli di pigmento sono mancanti in fig. 3B. Figura 3C mostra un esempio di analisi clonale. Drosophila Rho-chinasi (drok) è necessario per la rotazione ommatidial nonché per l'integrità strutturale dell'occhio 8. Omozigote drok 2 cloni possono essere identificate per l'assenza di pigmento nelle cellule del pigmento e la rhabdomeres (tipicamente, i cloni sono indotte usando senza occhi-FLP e un P-elemento con un gene marcatore fortemente espresso bianco a complemento di w sfondo - mutazione allo stato brado tipo e tessuto eterozigote). E 'così possibile identificare le aree mutante dalla mancanza di pigmento. A causa della cellula-autonomia della pigmentazione nel gruppo R-ceLLS accennato in precedenza, genotipi dei singoli R-cellule possono essere determinato (vedi punte di freccia in fig. 3C). <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Drosophila L'occhio è un sistema eccellente modello per i biologi in quanto, in contrasto con la superficie liscia di una wild-type occhio (A), la superficie di un occhio mutante esternamente è spesso approssimativa (B), indicativo di fenotipi occhio sottostante . In tutte le figure, è anteriore a sinistra e dorsale è alto. Immagini gentilmente concesse da Dr. Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, USA. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Luce immagini microscopiche dei singoli ommatidi sezionato con il metodo descritto. Solo sette R-cellule sono visibili in un momento per ommatidium, dal momento che R7 si trova in cima R8. (A, A ') A livello R7, il corpo cellulare di R7 viene rilevato tra R1 e R6 (freccia gialla in A'). Al contrario, a livello R8 (B), il corpo cellulare di R8 si rileva tra R1 e R2 (freccia gialla in B '). Punte di freccia blu segnano i granuli di pigmento che può essere usato come una cellula-autonomo marcatore pigmento. <img src="/files/ftp_upload/2959/2959fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Sezioni tangenziale attraverso wild-type (A), stbm (B) e drok (C) mutanti adulti occhi di Drosophila. Schemi sotto le sezioni indicano la polarità di ommatidi (vedi (A) per le frecce). Cerchi rappresentano ommatidi con difetti nel complemento di fotorecettori. Linee gialle rappresentano la linea dorsale / ventrale di simmetria (equatore). In contrasto con la ben orientata ommatidi di wild-type (A), l'organizzazione planare si perde nella mutante stbm (B). Si noti che la sezione del mutante stbm mostrato manca di pigmento per la sua w - sfondo mutante. (C) Perché drok mutazioni sono letali, devono essere analizzate in cloni. Così, le cellule pigmentate sono wild-type o eterozigoti (riempito punte di freccia blu), mentre la R-cellule del pigmento manca (aperto punte di freccia blu) sono omozigoti mutanti. Oltre a difetti di rotazione, i mutanti drok mostrano anche difetti strutturali compresi i numeri mancanti o in eccesso di R-cellule. Si noti che per l'analisi clonale, le sezioni non sono macchiate di evitare oscurando i granuli di pigmento.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Utilizzando Drosophila come organismo modello, schermi genetica ha portato all&#39;identificazione di molti dei membri fondatori di famiglie di geni essenziali per la maggior parte delle vie di segnalazione altamente conservata in eucarioti superiori inclusi gli esseri umani. Dal momento che, in condizioni di laboratorio, un occhio funzionale è dispensabile per la sopravvivenza, l&#39;occhio è un tessuto particolarmente adatto per la scoperta delle funzioni nuovo gene e la valutazione delle reti genetiche. Analisi ultrastrutturale dell&#39;occhio volo usando il metodo descritto così portato a scoperte fondamentali rilevanti per lo sviluppo e la malattia. Inizialmente, l&#39;analisi singola cellula clonale è stata effettuata utilizzando raggi X cloni indotti combinato con nota strettamente associata marcatori recessiva cellule autonome. Più recentemente, la disponibilità del FLP / FRT sistema per generare cloni ha notevolmente facilitato l&#39;analisi fenotipica delle mutazioni letali nelle sezioni occhi 6,9. Analisi delle sezioni occhio non è limitato alle sezioni tangenziali descritto qui. Se lo si desidera, le teste possono essere allineati in qualsiasi orientamento negli stampi e le sezioni trasversali possono essere ottenuti per studiare strati più profondi nella testa, come la lamina e midollo. Il protocollo qui descritto è quindi un metodo versatile per l&#39;analisi delle strutture oculari e della testa Drosophila adulti.

Attrezzature generiche: <ul><li> Per l&#39;allevamento volare generale vedi 10 </li><li> Dissezione microscopio standard (ad esempio Nikon SMZ-645 Zoom Stereo Microscope), con una sorgente di luce ad anello per evitare che un&#39;ombra delle tue mani. </li><li> CO 2 pad Fly, coperto con carta Whatman 3MM per fornire una protezione contro lo sporco durante la dissezione. </li><li> Gelatina vetrini rivestiti: sciogliere 10 g di gelatina e 1g CrKSO 4 x 12 H 2 O in acqua 1L su una piastra di riscaldamento (portare quasi a ebollizione, dura circa 2 ore). Immergere i vetrini ben lavati (sapone) e risciacquati (dH 2 O) in porta in soluzione di gelatina e asciugare coperti con un foglio di notte. </li><li> Forno di riscaldamento (70 ° C; forni a vuoto vecchi che sono stati utilizzati per l&#39;asciugatura del filtro di nitrocellulosa sono adatte per questo scopo). </li><li> Capace di sezionamento ultrasottili (0.5-1 sezioni micron di spessore) microtomo, ad esempio quelli utilizzati dalle strutture di microscopia elettronica. Usiamo un Sorvall MT5000 Ultramicrotomo con un coltello di diamante di qualità Histo. Coltelli di vetro anche di lavoro. </li></ul> Fissazione soluzioni: <ul><li> Preparare una soluzione madre di 0,2 M tampone fosfato di sodio, pH 7,2. </li><li> Preparare il 2% glutaraldeide in tampone di fosfato di sodio 0,1 M, pH 7,2 (può essere conservato a 4 ° C per 4 settimane). Fare almeno abbastanza per avere 200μl per genotipo si desidera incorporare. Tenere su ghiaccio. </li><li> Osmio soluzione: 2 OsO 4% in tampone fosfato di sodio 0,1 M, pH 7,2. Fare solo quanto basta per avere 200μl per genotipo si desidera incorporare, dal momento che la soluzione non può essere memorizzato. Tenere su ghiaccio. </li></ul> E glutaraldeide OsO 4 sono altamente tossici e devono essere maneggiati con estrema cura in una cappa ben ventilata. Utilizzare puntali con filtro quando si maneggia OsO 4 per evitare l&#39;annerimento della vostra pipetta. Disidratazione: Fai 30%, 50%, 70%, (80%), il 90%, e le soluzioni di etanolo al 100%. Preferibilmente fresco 30%, 50%, 70% di etanolo sul ghiaccio prima dell&#39;uso. Soluzione colorante: 1% toluidina-blu 1% borace. <table border="1"><tbody><tr><th></th><th> Morbido </th><th> Difficile </th></tr><tr><td> Una resina </td><td> 54g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> Indurente B </td><td> 44.5g </td><td> 50g </td></tr><tr><td> Acceleratore C </td><td> 2.5g </td><td> 1.75g </td></tr><tr><td> Plastificante D </td><td> 10g </td><td> 0,75 g </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Resina preparazione Per preparare la resina, con attenzione, ma mescolare bene tutti gli ingredienti in un bicchiere di plastica con un agitatore magnetico con ancoretta di grandi dimensioni. Evitare bolle. Dopo la miscelazione, aliquota in fiale di scintillazione standard o contenitori simili e congelare a -20 ° C. Usa resina morbida per tutte le applicazioni meno che il vostro impianto di EM chiede la formulazione più dura. Usare i guanti per maneggiare resina (cancerogeno nella sua forma non polimerizzato). Per polimerizzare resina su attrezzature e rifiuti, cuocere in forno a 70 ° C durante la notte. Rifiuti può quindi essere tranquillamente eliminate e attrezzature pulito e riutilizzato. Versato in resina non polimerizzato può essere pulito con isopropanolo. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Fornitore </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Fly Pad </td><td> ad esempio Genesee </td><td> 59-119 </td></tr><tr><td> Glutaraldeide </td><td> Sigma </td><td> G7526-10 X 10 ML </td></tr><tr><td> OsO 4 </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 0972A-20 </td></tr><tr><td> Propyleneoxide </td><td> Pescatore </td><td> 04332-1 </td></tr><tr><td> Maniglie bisturi, per # 3 </td><td> Pescatore </td><td> 22080046 </td></tr><tr><td> Lame di bisturi # 11 </td><td> Pescatore </td><td> 08-916-5B </td></tr><tr><td> Trasferimento di pipette </td><td> Pescatore </td><td> 13-711-7M </td></tr><tr><td> Durcupan (R) ACM resina </td><td> Sigma (Fluka) </td><td> 44610-1EA </td></tr><tr><td> Acciaio ago dissezione </td><td> Pescatore </td><td> S17346 </td></tr><tr><td> Beem stampo embedding piatto </td><td> Microscopia Elettronica Fantascienza. </td><td> 70904-12 </td></tr><tr><td> Lame di rasoio Teflon </td><td> Microscopia Elettronica Fantascienza. </td><td> 71970 </td></tr><tr><td> Q-tip (tamponi sterili) </td><td> Pescatore </td><td> 14-959-81 </td></tr><tr><td> Vetrini </td><td> Pescatore </td><td> 12-550-143 </td></tr><tr><td> Coprioggetto n. 1, 22x60 millimetri </td><td> Pescatore </td><td> 12-531K </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Pescatore </td><td> ICN96010280 </td></tr><tr><td> Cr (III) K SO 4 dodecaidrato </td><td> Sigma </td><td> 243361 </td></tr><tr><td> Diamante Histo coltello, 6mm </td><td> Diatome Stati Uniti </td><td> 60-La sua </td></tr><tr><td> Blu toluidina O </td><td> Pescatore </td><td> BP107-10 </td></tr><tr><td> Borace (Na-tetraborato) </td><td> Pescatore </td><td> AC20629-1000 </td></tr><tr><td> DPX montaggio medio </td><td> Sigma </td><td> 44581-100ML </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Materiale

preparazione di adulti drosophila occhi di sezionamento sottile e analisi microscopica

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila è stato a lungo utilizzato come sistema modello per studiare lo sviluppo, principalmente a causa della facilità con cui è geneticamente trattabili. Nel corso degli anni, una pletora di ceppi mutanti e trucchi tecnici sono stati sviluppati per permettere domande sofisticate per essere chiesto e ha risposto in un ragionevole lasso di tempo. Intuizione fondamentale nella interazione dei componenti di tutte le note principali vie di segnalazione sono state ottenute in avanti e indietro studi di genetica della Drosophila. L&#39;occhio vola ha dimostrato di essere particolarmente adatto per l&#39;analisi mutazionale, dal momento che, in condizioni di laboratorio, le mosche possono sopravvivere senza gli occhi funzionali. Inoltre, la superficie degli occhi degli insetti è composto da circa 800 occhi singola unità (faccette o ommatidi) che formano una regolare, liscia, visto sotto un microscopio da dissezione. Così, è facile vedere se una mutazione potrebbe influenzare lo sviluppo degli occhi o la crescita di esternamente alla ricerca per la perdita della superficie liscia (fenotipo &#39;occhio grezzi&#39;; Fig. 1.) O la dimensione complessiva degli occhi, rispettivamente (per gli esempi di schermi basati su morfologia occhio esterno si veda ad esempio 1). Successive analisi dettagliate dei fenotipi occhio richiedono fissazione, di inclusione e sottile sezionamento degli occhi adulti. L&#39;occhio di Drosophila sviluppa dal cosiddetto disco occhio immaginale, un sacco di cellule epiteliali che proliferano e si differenziano durante le fasi larvali e pupa (per una rassegna si veda ad esempio 2). Ogni ommatidium costituito da 20 celle, tra cui otto fotorecettori (PR o R-cellule;. Fig. 2), quattro lenti che secernono coni, le cellule del pigmento (&#39;esagono&#39; intorno a R-cell cluster) e una setola. I fotorecettori di ogni ommatidium, più facilmente identificati dai loro organelli sensibile alla luce, la rhabdomeres, sono organizzati in un trapezio formato da sei &quot;esterno&quot; (R1-6) e due &quot;interiore&quot; fotorecettori (R7 / 8; R8 [Fig. . 2] è sotto R7 e quindi visto solo nelle sezioni da zone più profonde degli occhi). Il trapezio di ogni sfaccettatura è proprio in linea con quelli dei suoi vicini e gli assi antero-posteriore e dorsoventrale complessivo dell&#39;occhio (Fig. 3A). In particolare, il ommatidi della dorsale e ventrale (frecce nere e rosso, rispettivamente) metà degli occhi sono immagini speculari l&#39;uno dell&#39;altro e corrispondono a due forme chirali stabilito durante la segnalazione di polarità planare delle cellule (per una rassegna si veda ad esempio 3). Il metodo per generare semi-sottili sezioni occhio (come quelli presentati in fig. 3) descritto qui è leggermente modificato rispetto a quello originariamente descritto da Tomlinson e Ready 4. Consente l&#39;analisi morfologica di tutte le cellule tranne le cellule cono trasparente. Inoltre, il pigmento di R-cellule (punte di freccia blu in fig. 2 e 3) può essere usato come una cellula-autonomo marcatore per il genotipo di un R-cell, i requisiti così genetica dei geni in un sottogruppo di R-cellule possono essere facilmente determinata 5,6.

Un approccio standard per la preparazione degli adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli occhi semi-sottile e leggero sezionamento analisi microscopica è presentato qui. Il protocollo può essere utilizzato per lordo analisi morfologica di difetti dell&#39;occhio, o con le modifiche indicate possono essere utilizzati per determinare i requisiti genetica dei geni in tipi cellulari specifici degli occhi (ad esempio l&#39;analisi clonale dei fotorecettori) o per analisi al microscopio elettronico.

Preparazione di adulti Drosophila Occhi di sezionamento sottile e analisi microscopica

Drosophila è stata a lungo utilizzata come sistema modello per studiare lo sviluppo, principalmente grazie alla facilità con cui è geneticamente trattabile. Nel corso degli anni, è stata sviluppata una pletora di ceppi mutanti e accorgimenti tecnici per consentire di porre e risolvere quesiti sofisticati in tempi ragionevoli. Studi di genetica forward e reverse in Drosophila hanno fornito informazioni fondamentali sull'interazione tra i componenti di tutte le principali vie di segnalazione note. L'occhio della mosca si è rivelato eccezionalmente adatto all'analisi mutazionale, poiché, in condizioni di laboratorio, le mosche possono sopravvivere senza occhi funzionali. Inoltre, la superficie dell'occhio dell'insetto è composta da circa 800 singoli occhi unitari (facette o ommatidi) che formano una superficie regolare e liscia se osservata al microscopio stereoscopio. Pertanto, è facile determinare se una mutazione influenzi lo sviluppo o la crescita dell'occhio osservando esternamente la perdita della superficie liscia (fenotipo "rough eye"; Fig. 1) o, rispettivamente, le dimensioni complessive dell'occhio (per esempi di screening basati sulla morfologia esterna dell'occhio, si veda ad es. 1). Le analisi dettagliate successive dei fenotipi oculari richiedono la fissazione, l'inclusione in resina plastica e il sezionamento sottile degli occhi adulti. L'occhio di Drosophila si sviluppa dal cosiddetto disco imaginale dell'occhio, un sacco di cellule epiteliali che proliferano e si differenziano durante gli stadi larvali e pupali (per una revisione, si veda ad es. 2). Ogni ommatidio è costituito da 20 cellule, tra cui otto fotorecettori (PR o cellule R; Fig. 2), quattro cellule coniche che secernono la lente, cellule pigmentate ("esagono" attorno al cluster di cellule R) e una setola. I fotorecettori di ogni ommatidio, identificabili più facilmente dai loro organelli fotosensibili, i rabdomeri, sono organizzati in un trapezio composto da sei fotorecettori "esterni" (R1-6) e due fotorecettori "interni" (R7/8; R8 [Fig. 2] si trova al di sotto di R7 e quindi è visibile solo in sezioni di aree più profonde dell'occhio). Il trapezio di ogni facetta è allineato con precisione con quelli delle vicine e con gli assi complessivi anteroposteriore e dorsoventrale dell'occhio (Fig. 3A). In particolare, gli ommatidi delle metà dorsale e ventrale dell'occhio (frecce nere e rosse, rispettivamente) sono immagini speculari l'uno dell'altro e corrispondono a due forme chirali stabilite durante la segnalazione della polarità cellulare planare (per una revisione, si veda ad es. 3). Il metodo per generare sezioni oculari semi-sottili (come quelle presentate nella Fig. 3) qui descritto è leggermente modificato rispetto a quello originariamente descritto da Tomlinson e Ready4. Esso consente l'analisi morfologica di tutte le cellule, eccetto le cellule coniche trasparenti. Inoltre, il pigmento delle cellule R (punte di freccia blu nelle Fig. 2 e 3) può essere utilizzato come marcatore cellulo-autonomo per il genotipo di una cellula R, permettendo così di determinare facilmente i requisiti genetici di specifici geni in un sottinsieme di cellule R5,6.

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare gli occhi di drosophila adulti per la sezione sottile, consentendo una valutazione dettagliata dei fenotipi oculari mutanti, come ad esempio difetti della polarità cellulare planare. Questo viene ottenuto innanzitutto tagliando le teste delle mosche anestetizzate. Il tessuto oculare viene quindi fissato e incluso in una resina epossidica.Una volta che la resina è solidificata, gli occhi inclusi vengono sagomati. Per il taglio, l'ultimo passaggio consiste nel realizzare sezioni sottili degli occhi utilizzando un microtomo dotato di una lama di diamante. Infine, l'analisi della sezione oculare permetterà la caratterizzazione dei fenotipi oculari di nuovi mutanti o la quantificazione di interazioni genetiche tra geni di un percorso di segnalazione, come il percorso PCP.Entrambi contribuiranno a caratterizzare il ruolo fisiologico di geni appena identificati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della drosophila, come ad esempio in che modo nuove mutazioni influenzano lo sviluppo dell'occhio, o come i geni interagiscono in saggi di interazione genetica. Diversi passaggi della procedura di inclusione dell'occhio, come l'allineamento degli occhi negli stampi per sezionamento, sono molto più facili da comprendere in forma visiva piuttosto che testuale. Per iniziare, indossare un paio di guanti in previsione della fissazione delle teste di moscerino e dell'uso di glutaraldeide e osmio, entrambi sostanze chimiche tossiche.Successivamente, anestetizzare le mosche utilizzando CO2 e farle cadere su un apposito tappetino per mosche protetto da carta Watman sotto un microscopio stereoscopico; selezionare tipicamente sei mosche più una mosca aggiuntiva per garantire sei capi inclusi per genotipo. Premere delicatamente il torace della mosca con pinzette e quindi rimuovere la testa della mosca usando un bisturi. Stabilizzare la testa toccando il collo con le pinzette e tagliare con attenzione una piccola parte di uno degli occhi per favorire la penetrazione del fissativo. Toccare la testa con le pinzette o il bisturi sulla superficie dell'occhio reciso per trasferire la testa nel fissativo di glutaraldeide in tampone fosfato posto sul ghiaccio. Indossare sempre guanti durante tutto il processo di fissazione.Etichettare innanzitutto tutti gli stampi per tenere traccia dei diversi genotipi. Successivamente, riempire ogni stampo con resina al 100%, avendo cura di non riempirli eccessivamente. La superficie superiore deve essere piatta.Utilizzando una pipetta di trasferimento, rimuovere la resina al 50% dalle teste. Sostituire con resina al 100% e incubare per tre o quattro ore a temperatura ambiente. Mentre le teste raggiungono l'equilibrio nella resina durante l'incubazione, affonderanno sul fondo del tubo.Battere un bastoncino di legno su una superficie dura per creare un piccolo gancio. Utilizzando questo strumento, trasferire una singola testa di moscerino in ogni stampo. Posizionare della carta d'alluminio sull'area di lavoro del microscopio stereoscopico per proteggerla dalla fuoriuscita di resina.Con l'aiuto del microscopio stereoscopico, utilizzare l'ago da dissezione per ruotare leggermente e con attenzione la testa. Posizionarla nella parte inferiore dello stampo, vicino all'estremità appuntita. Allineare con cura la superficie dell'occhio intatto con la parete frontale dello stampo, con il collo rivolto verso il basso.Assicurarsi di mantenere la superficie tangenziale dell'occhio, approssimativamente a metà del diametro della testa di distanza dalla parete dello stampo. Se gli occhi si spostano durante la rimozione dell'ago da dissezione, riposizionare gli occhi nella posizione desiderata, ritrarre rapidamente leggermente l'ago dalla testa e quindi rimuovere lentamente l'ago completamente. Una volta allineate tutte le teste, verificare nuovamente tutti gli occhi per assicurarsi che non si siano mossi.Quando si estrae l'ago dalla resina, se necessario o se è storto riallineare la punta, trasferire gli stampi in un forno e cuocerli a 70 gradi tutta la notte. Dopo la cottura notturna, rimuovere i blocchi induriti dagli stampi piegando gli stampi stessi. Tenere traccia di quale blocco corrisponde a quale genotipo conservandoli in contenitori etichettati.Per rifinare i blocchi, montare un blocco su un mandrino del microtomo in modo che l'occhio sia rivolto verso l'alto sotto la lente del microscopio stereoscopico. Utilizzando una lametta rivestita in teflon, tagliare con attenzione solo lo strato superiore del blocco. Questo lascia una superficie limpida attraverso cui è possibile vedere l'occhio e stabilire il piano di sezionamento.Successivamente, rimuovere l'eccesso di plastica su entrambi i lati della testa e sulla parte anteriore finché la maggior parte della plastica intorno alla testa non è stata eliminata. È preferibile avvicinarsi lentamente alla testa rimuovendo più strati sottili di plastica mediante una lama di rasoio pulita. Rimuovere con attenzione strati sottili dalla sommità dell'occhio esattamente nel piano desiderato di sezionamento.Assicurarsi di utilizzare aree fresche della lama del rasoio per ogni taglio e continuare fino a quando si raggiunge la superficie esterna dell'occhio. Il blocco risultante sarà una piramide a tre lati con un apice leggermente inclinato corrispondente al piano di sezionamento. Montare il blocco nel microtomo e iniziare la sezionatura.Finché non sono state prodotte da 20 a 30 sezioni, le sezioni risultanti galleggeranno sulla superficie dell'acqua nel serbatoio. Posizionare un vetrino su una piastra riscaldante impostata a 100 gradi Celsius. Sollevare quindi il primo lotto di sezioni con l'estremità appiattita di un bastoncino di legno usando un movimento rotatorio da sotto la superficie dell'acqua, e trasferirle successivamente in una goccia d'acqua.Sul vetrino, attendere finché l'acqua non sarà evaporata e le sezioni non saranno aderenti al vetrino, quindi ripetere con altre 20-30 sezioni. Tipicamente, sezioni di tre occhi posizionati in sei gocce d'acqua si dispongono bene su un singolo vetrino. Una volta raccolte tutte le sezioni sul vetrino, possono essere colorate e montate per l'analisi al microscopio in una sezione tangenziale attraverso l'occhio di una mosca con occhio selvatico.Il TIA mostra una polarità normale ed è ben orientato rispetto alla linea di simmetria dorso-ventrale, indicata da una linea gialla nello schema sottostante. In contrasto con il TIA ben orientato dell'occhio di tipo selvatico, nell'occhio di un mutante strabismus la polarità del TIA è persa, e anche se è presente il completo complemento di fotorecettori, la rotazione e l'orientamento sono casuali. Si noti inoltre l'assenza del pigmento nel reticolo delle cellule pigmentate e nelle singole cellule fotorecettrici.Dato che il ceppo mutante strabismus era in un background genetico white minus, la chinasi drosophila ro o drop è una mutazione letale omozigote, che richiede quindi un'analisi clonale. Qui, i cloni omozigoti mutanti sono identificati dall'assenza di pigmento e mostrano difetti di rotazione, oltre a difetti strutturali, a livello cellulare singolo, inclusi un numero mancante o eccessivo di cellule fotorivelatrici. Esempi di fotorivelatrici mutanti e di tipo selvatico sono indicati rispettivamente da frecce blu vuote o piene.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incorporare e sezionare gli occhi della mosca. Entro circa tre giorni, dovresti essere in grado di analizzare in dettaglio i fenotipi oculari, permettendoti di studiare la funzione di geni nuovi durante lo sviluppo dell'occhio.

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