Arricchimento di fosfopeptidi a base di biossido di titanio: un metodo per l'isolamento selettivo di fosfopeptidi dalla libreria di peptidi

I fosfopeptidi sono brevi stringhe di amminoacidi contenenti residui fosforilati di serina, treonina o tirosina. Per isolare i fosfopeptidi da una miscela di peptidi, inizia prendendo le perle di biossido di titanio in una provetta. Equilibrare per condizionare le perle utilizzando un opportuno tampone legante acidificato contenente un agente estinguente. Aggiungere la concentrazione desiderata di miscela di peptidi all'impasto perlato

Incubare la miscela agitando continuamente per evitare che le perle si depositino. La condizione acida favorisce il gruppo fosfato dei fosfopeptidi a formare legami coordinati con le perle di titanio. L'agente di tempra nel tampone riduce qualsiasi legame aspecifico di peptidi non fosforilati alle perle, lasciandoli nella sospensione.

Centrifuga per pellettizzare le perle legate al fosfopeptide, mentre i peptidi non fosforilati rimangono nel surnatante. Scartare il surnatante. Trasferire le perle legate al fosfopeptide in una colonna filtrante rotante preassemblata. Centrifugare per rimuovere il tampone legante e intrappolare le perle coniugate con fosfopeptide.

Trasferire il filtro in un tubo pulito e aggiungere una soluzione contenente ammoniaca. L'ammoniaca trasforma la sospensione basica, provocando il distacco dei fosfopeptidi dalle perline. Centrifugare l'assemblaggio per eluire e raccogliere i fosfopeptidi non legati. Le perle di biossido di titanio rimangono nella cartuccia del filtro. Asciugare i fosfopeptidi per eliminare eventuali tracce di ammoniaca.

Precondizionare il biossido di titanio con 500 microlitri di ACN al 100% due volte. Quindi, condizionare il biossido di titanio con 500 microlitri di tampone fosfato di sodio 0,2 M, pH 7, due volte. Infine, utilizzare 300 microlitri di tampone di equilibrio per lavare le perle tre volte. Aggiungere 400 microlitri di ACN al 50% e TFA allo 0,1% alla provetta a basso legame proteico. Quindi, aggiungere 84 microlitri di acido lattico.

Trasferire i fosfopeptidi risospesi nella provetta a basso legame proteico e incubarli a temperatura ambiente utilizzando un rotatore end-over-end per 1 ora. Dopo aver pellettato le perline, utilizzare 300 microlitri di tampone di equilibrio per lavarle due volte e farle girare verso il basso. Con 300 microlitri di tampone di risciacquo, sciacquare le perle due volte. Quindi, trasferiscili in un filtro rotante da 0,2 micrometri.

Dopo la centrifuga, trasferire l'unità filtrante in un tubo pulito da 1,5 millilitri a basso contenuto proteico e, con 200 microlitri di ammonio allo 0,9% in acqua, eluire il contenuto due volte. Dopo aver controllato il pH, concentrare sotto vuoto l'eluato fino a renderlo asciutto durante la notte per far evaporare l'ammoniaca.