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0 visualizzazioni • 3:20 min. • April 30th, 2023
Gli sferoidi sono colture in vitro di cellule auto-aggregate per formare strutture sferiche tridimensionali. Per la propagazione degli sferoidi tumorali, iniziare con gli sferoidi coltivati in una matrice extracellulare adatta, o ECM, contenuta in una piastra di coltura.
Triturare utilizzando una micropipetta per rompere meccanicamente la MEC e allentare gli sferoidi. Trasferire la miscela sferoide-ECM in una provetta da microcentrifuga.
Centrifugare a bassa velocità per pellettizzare gli sferoidi e separarli dall'ECM nel surnatante. Scartare il surnatante contenente ECM esaurito. Trasferire il tubo contenente il pellet di sferoide sul ghiaccio per evitare la solidificazione della ECM durante le fasi successive.
Integrare il pellet con ECM liquefatto fresco. Per la sub-coltura, mescolare il contenuto pipettando ripetutamente su e giù per dissociare le cellule sferoidi e rilasciarle in sospensione.
Semina questa miscela contenente cellule che formano sferoidi e ECM in un piatto di coltura fresco. La ECM si solidifica, consentendo l'intrappolamento delle cellule tumorali. Aggiungi il terreno di coltura desiderato. Incubare per facilitare la crescita delle cellule intrappolate in nuovi sferoidi.
Ai fini della spedizione, trasferire la miscela sferoide-ECM in un pallone di coltura. Consenti all'ECM di solidificarsi e intrappolare gli sferoidi all'interno.
Riempire il pallone con terreno di coltura per evitare il taglio delle cellule e mantenere la vitalità degli sferoidi. Trasferisci il pallone in un pacco di spedizione.
Rompere meccanicamente l'ECM con una pipetta P1000 e trasferirla in una provetta sterile da 1,5 millimetri. Centrifugare la provetta a 1.000 x g a 4 gradi Celsius. Quindi, rimuovere tutto il surnatante e posizionare il tubo sul ghiaccio. Aggiungere da due a quattro volte il volume di nuova ECM al pellet e miscelare il contenuto della provetta pipettando su e giù 10 volte, assicurandosi di evitare l'introduzione di bolle d'aria.
Trasferire da 5 a 20 microlitri di ECM nella miscela SBNET in una nuova piastra a 96 pozzetti e lasciare solidificare l'ECM. Quindi, coprire l'ECM solidificato con il nuovo terreno SBNET e inserire la piastra nell'incubatore. Se si spediscono sferoidi SBNET a un altro laboratorio, trasferire gli sferoidi con il nuovo ECM in un pallone T25 e lasciare che l'ECM si solidifichi. Riempire il pallone con il terreno sferoidale SBNET, avvitare saldamente il tappo e preparare il pacco di spedizione.