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La vitrificazione, una tecnica di crioconservazione ultrarapida, consente di raffreddare cellule e tessuti viventi e di conservarli a temperature estremamente basse per periodi molto lunghi.
Per vitrificare un tessuto tumorale appena raccolto, per prima cosa, prendi il tessuto su una piastra di coltura. Asportare eventuali regioni necrotiche, regioni contenenti grasso o coaguli di sangue dal tumore. Lavare il fazzoletto per rimuovere eventuali tracce di sangue.
Tagliare il fazzoletto a fette di spessore adeguato. A questo punto, trasferire le fette in una provetta contenente una soluzione di vetrificazione che costituisce DMSO, o dimetilsolfossido, e saccarosio. Questi costituenti agiscono come crioprotettori per proteggere le cellule dai danni da congelamento.
Incubare a bassa temperatura. Il DMSO, un crioprotettore che permea le cellule, si diffonde attraverso la membrana cellulare e sostituisce l'acqua nelle cellule per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio intracellulari. Allo stesso tempo, il saccarosio, un crioprotettore non permeante, agisce a livello extracellulare facilitando la disidratazione cellulare e riducendo la formazione di cristalli di ghiaccio intracellulari per mitigare il rischio di morte cellulare.
Posizionare le fette tumorali equilibrate su un supporto per fazzoletti. Quindi, trasferire questo gruppo in azoto liquido per congelare a meno 196 gradi Celsius. Questo rapido raffreddamento si traduce in una vetrificazione del campione che solidifica il tessuto in uno stato vetroso e amorfo, mentre l'alta concentrazione di crioprotettori previene la formazione di cristalli di ghiaccio e il danneggiamento cellulare.
Il tessuto vitrificato rimane in uno stato di attività metabolica sospesa.
Dopo l'eutanasia dei topi, usa pinze e forbici sterili per isolare lentamente il tumore dai topi. Lavare i tessuti tumorali in DPBS e in un piatto da 10 centimetri. Usa pinze e forbici per sezionare e rimuovere aree necrotiche, tessuto adiposo, coaguli di sangue e tessuto connettivo.
Successivamente, utilizzare uno stampo per tagliare i tessuti tumorali a uno spessore massimo di 1 millimetro. Lavare le fette tumorali con DPBS in un piatto da 10 centimetri. Per iniziare il processo di vitrificazione, utilizzare una pinza per trasferire le fette nella provetta V1 e incubare a 4 gradi Celsius per 4 minuti. Arrotolare e capovolgere brevemente la provetta e incubare a 4 gradi Celsius per altri 4 minuti.
Quindi, versare la soluzione V1 e le fette in un piatto da 10 centimetri e utilizzare una pinza per trasferire le fette nel tubo V2. Incubare a 4 gradi Celsius per 4 minuti. Arrotolare e capovolgere brevemente la provetta e incubare a 4 gradi Celsius per altri 4 minuti. Dopodiché, versare la soluzione V2 e le fette in un piatto da 10 centimetri.
Trasferire le fette nella provetta V3 e incubare a 4 gradi Celsius per 5 minuti. Arrotolare e capovolgere brevemente la provetta e incubare a 4 gradi Celsius per altri 5 minuti.
Assicurati che tutte le fette affondino sul fondo del tubo. Se più fette rimangono galleggianti, arrotolare e capovolgere brevemente la provetta e incubare a 4 gradi Celsius fino a quando tutte le fette non affondano completamente. Quindi, versare la soluzione V3 e le fette in un piatto da 10 centimetri. Tagliare i portafazzoletti alla lunghezza corretta e posizionarli su una garza sterile. Trasferire le fette sui supporti. Avvolgere i supporti con una garza.
Usando una pinza, metti i supporti nell'azoto liquido e lasciali incubare per 5 minuti. Successivamente, etichettare le fiale criogeniche con le informazioni sul tessuto. Trasferire i supporti con fette di tessuto nelle fiale, che verranno conservate in azoto liquido.