Microscopia a fluorescenza di trappole extracellulari neutrofile o NET: una tecnica per osservare l'interazione adesiva tra cellule tumorali e NET

In condizioni patologiche come il cancro, i neutrofili attivati rilasciano trappole extracellulari per neutrofili o NET - una rete di DNA extracellulare con enzimi associati e proteine antimicrobiche - che intrappolano le cellule tumorali circolanti.

Per visualizzare l'interazione adesiva tra NET e cellule tumorali in vitro, iniziare coltivando neutrofili a bassa densità, un sottotipo di neutrofili, in un piatto di coltura rivestito di polimero che promuove l'adesione cellulare. Incubare per alcune ore per stimolare i neutrofili a formare NET simili a ragnatele.

Aggiungere una sospensione di cellule tumorali marcate con fluoresceina rossa alla coltura dei neutrofili. Incubare le cellule tumorali con NET per un breve periodo per facilitare l'interazione cellula tumorale-NET. Il NET-DNA agisce come un fattore chemiotattico che attrae le cellule tumorali e ne promuove l'adesione ai NET.

Rimuovere il mezzo esaurito. Lavare delicatamente la coltura con un terreno fresco adatto per rimuovere bene eventuali cellule tumorali non attaccate dalla coltura.

Ora, aggiungi una colorazione nucleare fluorescente verde impermeabile alla membrana per colorare selettivamente i NET extracellulari. Osservare la coltura al microscopio a fluorescenza. Le trappole extracellulari dei neutrofili appaiono come strutture verdi simili a corde che formano una rete a cui sono attaccate le cellule tumorali rosse.

Risospendere i neutrofili isolati a bassa densità a una risoluzione di 5 volte 10 al sesto di cellule per millilitro di terreno RPMI 1640 integrato con concentrazione di FBS e seminare 1 millilitro di neutrofili per pozzetto su una piastra rivestita di poli-L-lisina a 6 pozzetti. Dopo 2 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, colorare le cellule in ciascun pozzetto con un colorante nucleare e cromosomico fluorescente impermeabile alla membrana secondo le istruzioni del produttore e osservare immediatamente la morfologia dei NET mediante microscopia a fluorescenza.

Per valutare l'adesione delle cellule tumorali ai NET, risospendere le cellule tumorali gastriche colorate con un colorante fluorescente contrastante a una velocità compresa tra 1 e 10 e il sesto per millilitro di RPMI 1640 integrato con una concentrazione di albumina sierica bovina dello 0,1% e aggiungere 1 millilitro di cellule tumorali a ciascun pozzetto delle colture di neutrofili a bassa densità. Dopo 5 minuti a 37 gradi Celsius, rimuovere il surnatante da ciascun pozzetto e lavare delicatamente le celle due volte con 2 millilitri di terreno RPMI 1640 preriscaldato integrato con BSA per lavaggio.

Un'incubazione di 5 minuti è sufficiente per rilevare il legame specifico di NET. Aggiungere lentamente il terreno caldo sul lato di ogni pozzetto, agitare delicatamente la piastra e rimuovere il surnatante con un aspiratore.

I NET e le cellule tumorali attaccate possono quindi essere osservati mediante microscopia a fluorescenza.