Immunocolorazione con oro delle sezioni esosomiali: una tecnica per visualizzare i marcatori diagnostici nel lume esosomiale

0 views • 3:36 min • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli esosomi sono piccole vescicole extracellulari che racchiudono una varietà di biomolecole che fungono da biomarcatori del cancro.

Per visualizzare i biomarcatori esosomiali, iniziare con sezioni esosomiali ultrasottili incorporate in resina supportate su apposite griglie metalliche per microscopia elettronica. Incubare le griglie in gocce di glicina. La glicina lega e neutralizza i gruppi aldeidici reattivi nelle sezioni per superare la loro interferenza con il saggio.

Sciacquare il campione con acqua per rimuovere i reagenti residui. Successivamente, incubare il campione in un tampone di blocco. Il tampone trasporta le proteine sieriche che bloccano i siti di legame degli anticorpi non specifici nel campione.

Quindi, incubare il campione nella soluzione di anticorpi primari desiderata. Questi anticorpi riconoscono e si legano ai loro biomarcatori bersaglio localizzati nel lume esosomiale. Lavare via gli anticorpi non legati con un tampone adatto.

A questo punto, trasferire le griglie portacampioni in gocce contenenti anticorpi secondari coniugati con oro che si attaccano agli anticorpi primari. Le nanoparticelle d'oro fungono da marcatori densi di elettroni per visualizzare la localizzazione fine delle molecole bersaglio. Lavare via eventuali anticorpi secondari non legati con un tampone adatto.

Infine, in condizioni di buio, incubare le griglie in sequenza in soluzioni di acetato di uranile e citrato di piombo. Questi reagenti di metalli pesanti colorano e migliorano il contrasto delle molecole organiche come lipidi, proteine e glicogeni nel campione, differenziandole dallo sfondo.

Osservare le sezioni colorate al microscopio elettronico a trasmissione. I biomarcatori marcati con oro appaiono come particelle scure all'interno del lume delle strutture esosomiche colorate di metalli pesanti.

Per iniziare, incubare griglie contenenti sezioni non colorate spesse 60 nanometri in gocce da 50 microlitri di glicina 0,02 M per 10 minuti per estinguere i gruppi aldeidici liberi. Quindi, sciacquare le sezioni in 100 microlitri di acqua distillata tre volte per 10 minuti ciascuna. Dopo l'ultimo risciacquo, incubare le sezioni per 1 ora a temperatura ambiente in PBS contenente l'1% di BSA. Quindi, incubare le griglie in gocce da 50 a 100 microlitri di un anticorpo anti-KRS per 1 ora.

Successivamente, lavare le griglie cinque volte per 10 minuti ciascuna in una goccia di PBS contenente lo 0,1% di BSA. Quindi, trasferire le griglie in una goccia di un anticorpo secondario appropriato e incubare le sezioni per 1 ora a temperatura ambiente. Ora, lava le griglie cinque volte per 10 minuti ciascuna con una goccia separata di PBS contenente lo 0,1% di BSA. Colorare due volte le sezioni con acetato di uranile al 2% per 20 minuti al buio, seguito dal citrato di piombo di Reynold per 10 minuti. Posizionare la sezione colorata in un microscopio elettronico a trasmissione e visualizzare il campione utilizzando 80 kV e visualizzarlo utilizzando il software del microscopio.

11:38

Un metodo innovativo per Exosome quantificazione e Size Measurement

Related Videos

0 Views

09:43

Semplificato umani neutrofili extracellulari Traps (NET) Isolamento e Manipolazione

Related Videos

0 Views

13:45

Valutazione della funzione delle vescicole extracellulari durante l'infezione malarica

Related Videos

0 Views

09:43

Isolamento e caratterizzazione di RNA contenenti esosomi

Related Videos

0 Views

09:49

Nanogold Etichettatura del Sistema lievito endosomiale per le analisi ultrastrutturali

Related Videos

0 Views

09:24

Risoluzione alta analisi quantitativa Immunogold di Recettori di membrana a retina nastro Sinapsi

Related Videos

0 Views

08:49

Exosomal Analisi miRNA in non a piccole cellule del cancro del polmone (NSCLC) dei pazienti plasma attraverso qPCR: Un fattibile Liquido biopsia Strumento

Related Videos

0 Views

11:15

Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

Related Videos

0 Views

09:16

Rapida caratterizzazione basata sulla fluorescenza delle singole vescicole extracellulari nel sangue umano con analisi Nanoparticle tracking

Related Videos

0 Views

09:30

Utilizzando Nanoplasmon-diffusione migliorata e imaging del microscopio a basso ingrandimento per quantificare gli esosomi derivati dal tumore

Related Videos

0 Views

Last updated: 18 July 2026