Immunocolorazione con oro delle sezioni esosomiali: una tecnica per visualizzare i marcatori diagnostici nel lume esosomiale

Gli esosomi sono piccole vescicole extracellulari che racchiudono una varietà di biomolecole che fungono da biomarcatori del cancro.

Per visualizzare i biomarcatori esosomiali, iniziare con sezioni esosomiali ultrasottili incorporate in resina supportate su apposite griglie metalliche per microscopia elettronica. Incubare le griglie in gocce di glicina. La glicina lega e neutralizza i gruppi aldeidici reattivi nelle sezioni per superare la loro interferenza con il saggio.

Sciacquare il campione con acqua per rimuovere i reagenti residui. Successivamente, incubare il campione in un tampone di blocco. Il tampone trasporta le proteine sieriche che bloccano i siti di legame degli anticorpi non specifici nel campione.

Quindi, incubare il campione nella soluzione di anticorpi primari desiderata. Questi anticorpi riconoscono e si legano ai loro biomarcatori bersaglio localizzati nel lume esosomiale. Lavare via gli anticorpi non legati con un tampone adatto.

A questo punto, trasferire le griglie portacampioni in gocce contenenti anticorpi secondari coniugati con oro che si attaccano agli anticorpi primari. Le nanoparticelle d'oro fungono da marcatori densi di elettroni per visualizzare la localizzazione fine delle molecole bersaglio. Lavare via eventuali anticorpi secondari non legati con un tampone adatto.

Infine, in condizioni di buio, incubare le griglie in sequenza in soluzioni di acetato di uranile e citrato di piombo. Questi reagenti di metalli pesanti colorano e migliorano il contrasto delle molecole organiche come lipidi, proteine e glicogeni nel campione, differenziandole dallo sfondo.

Osservare le sezioni colorate al microscopio elettronico a trasmissione. I biomarcatori marcati con oro appaiono come particelle scure all'interno del lume delle strutture esosomiche colorate di metalli pesanti.

Per iniziare, incubare griglie contenenti sezioni non colorate spesse 60 nanometri in gocce da 50 microlitri di glicina 0,02 M per 10 minuti per estinguere i gruppi aldeidici liberi. Quindi, sciacquare le sezioni in 100 microlitri di acqua distillata tre volte per 10 minuti ciascuna. Dopo l'ultimo risciacquo, incubare le sezioni per 1 ora a temperatura ambiente in PBS contenente l'1% di BSA. Quindi, incubare le griglie in gocce da 50 a 100 microlitri di un anticorpo anti-KRS per 1 ora.

Successivamente, lavare le griglie cinque volte per 10 minuti ciascuna in una goccia di PBS contenente lo 0,1% di BSA. Quindi, trasferire le griglie in una goccia di un anticorpo secondario appropriato e incubare le sezioni per 1 ora a temperatura ambiente. Ora, lava le griglie cinque volte per 10 minuti ciascuna con una goccia separata di PBS contenente lo 0,1% di BSA. Colorare due volte le sezioni con acetato di uranile al 2% per 20 minuti al buio, seguito dal citrato di piombo di Reynold per 10 minuti. Posizionare la sezione colorata in un microscopio elettronico a trasmissione e visualizzare il campione utilizzando 80 kV e visualizzarlo utilizzando il software del microscopio.

• Exosomes - Small extracellular vesicles enclosing cancer biomarkers.
• Glycine - A compound used to bind and neutralize reactive aldehyde groups.
• Blocking Buffer - A solution containing serum proteins that block non-specific antibody binding sites.
• Primary Antibody - A protein that recognizes and binds to target biomarkers in the exosomal lumen.
• Secondary Antibodies - Proteins tagged with gold-nanoparticles used to visualize primary antibodies.

• Introduce Exosomes - Definition and importance in cancer diagnosis (e.g., exosomes).
• Outline Glycine's Role - Its function in stabilizing exosomal structures (e.g., glycine).
• Explain Blocking Buffer - Serum proteins preventing unwanted reactions (e.g., blocking buffer).
• Educate on Antibody Tagging - Importance in visualizing exosomal biomarkers.

• What are exosomes and how do they serve as cancer biomarkers?
• What is the role of glycine in visualizing exosomal biomarkers?
• Why is a blocking buffer used in this process?

• Practical Application - Exosomes as diagnostic tools in cancer studies (e.g., exosome detection).
• Industry Impact - Enhancement of diagnostic accuracy in healthcare (e.g., cancer diagnostics).
• Societal Importance - Improving early detection and treatment strategies (e.g., personalized medicine).
• Scientific Advancements - Advancements in biomarker detection techniques.