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Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 3:17 min. • April 30th, 2023
Le cellule staminali del glioma o GSC sono una sottopopolazione del glioma, un cancro delle cellule gliali nel cervello.
L'etichettatura di queste GSC con enzimi bioluminescenti come la luciferasi aiuta a stabilire saggi di imaging ad alto rendimento per lo screening dei farmaci.
Per preparare le GSC marcate con luciferasi, iniziare con una coltura di GSC in un terreno di crescita adatto.
Centrifugare la coltura per ottenere un pellet cellulare e rimuovere il surnatante.
Aggiungere enzimi digestivi adatti al pellet. Questi enzimi dissociano i cluster cellulari e degradano qualsiasi traccia di tessuto connettivo per ottenere una sospensione unicellulare.
A questo punto, centrifugare la sospensione a cellula singola e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in un mezzo nuovo.
Quindi, seminare la concentrazione desiderata di cellule in una piastra di coltura.
Incubare la coltura e lasciare che le cellule aderiscano alla piastra di coltura.
Successivamente, aggiungere il titolo desiderato di un costrutto genico contenente virus per la proteina fluorescente verde potenziata con luciferasi o EGFP e incubare.
Il virus interagisce con i recettori di superficie delle GSC, innescando il rilascio di RNA virale contenente luciferasi-EGFP. Gli enzimi cellulari catalizzano la trascrizione inversa dell'RNA in DNA a doppio filamento e lo integrano nel genoma delle GSC.
Quando visualizzate al microscopio a fluorescenza, le cellule che esprimono luciferasi appaiono verdi a causa della fluorescenza emessa dall'EGFP.
Iniziare raccogliendo le cellule staminali del glioma o GSC dal terreno di coltura e centrifugandole a 70 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver rimosso il surnatante, digerire le cellule con accutasi per 4 minuti a 37 gradi Celsius.
Utilizzando un puntale da 200 microlitri, pipettare ripetutamente le cellule per dissociare e risospendere il pellet cellulare. Aggiungere le GSC a una densità di 200.000 cellule in 1 millilitro di terreno di coltura in ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 12 pozzetti e incubarle durante la notte.
Il giorno successivo, aggiungere 30 microlitri di surnatante del virus luciferasi-EGFP in ciascun pozzetto della piastra. Centrifugare le cellule a 1.000 x g per 2 ore a 25 gradi Celsius e incubarle durante la notte.
Il giorno seguente, sostituire il terreno nei pozzetti raccogliendo le GSC, centrifugandole, rimuovendo il surnatante, risospendendole in terreno fresco e riplaccandole. Coltivare le cellule per altre 48 ore.
Osservare la piastra al microscopio a fluorescenza e confermare la comparsa di cellule GFP-positive.