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0 visualizzazioni • 4:00 min. • April 30th, 2023
L'ubiquitinazione delle proteine è caratterizzata dall'aggiunta di ubiquitina - una mini-proteina regolatrice - attraverso i suoi residui di diglicina ai residui di lisina della proteina substrato. Questo genera un legame lisina-glicina-glicina tra la proteina substrato e l'ubiquitina.
Per isolare i peptidi marcati con ubiquitina, inizia prendendo una miscela di peptidi.
Trattare questi peptidi con un cocktail di enzimi endonucleasi. Durante il trattamento, gli enzimi Lys-C e tripsina scindono efficacemente i peptidi ubiquitinilati sul residuo di arginina, dando luogo a frammenti peptidici contenenti un motivo caratteristico della diglicina.
Aggiungere questi frammenti di peptidi a un impasto di perle di idrogel coniugato con anticorpi.
Questi anticorpi contengono un sito di riconoscimento della di-glicina, che si lega esclusivamente ai peptidi ubiquitinilati, formando un complesso peptide-perlina.
Centrifuga per pellettizzare complessi peptidico-perline ubiquitinilate. Rimuovere il surnatante non legato contenente peptide non ubiquitinilato.
Caricare i complessi su un gruppo filtro. Centrifugare per rimuovere il tampone e intrappolare le perle coniugate con peptidi.
Aggiungere un reagente acidificato che abbassa il pH, provocando il disaccoppiamento dei peptidi dalle perle.
Recuperare i peptidi liberi dal filtrato. Caricarli su un filtro nuovo con matrice idrofobica. I peptidi si trattengono nella matrice mentre i sali acidi vengono lavati via.
Utilizzando un solvente adatto, staccare i peptidi.
Trasferire i peptidi ubiquitinilati in una provetta nuova e asciugarli per rimuovere eventuali tracce di solvente.
Un lotto di anticorpi del motivo residuo di ubiquitina coniugati al liquame di perle di agarosio della proteina A viene diviso in sei frazioni uguali. Sciogliere le tre frazioni peptidiche secondo le indicazioni del manoscritto e centrifugare i detriti.
Aggiungere i surnatanti delle tre frazioni all'impasto perlato mantenendo le altre tre frazioni sul ghiaccio e incubarle per 2 ore a 4 gradi Celsius su un'unità rotante.
Quindi, fai girare le perline. Trasferire il surnatante in un nuovo lotto di perle e ripetere l'incubazione con le restanti tre frazioni di liquame di perle.
Conservare i surnatanti per la successiva analisi globale del proteoma e trasferire le perle in puntali per pipette da 200 microlitri dotati di tappo con filtro GF/F.
Mettere i puntali in provette da 1,5 millilitri dotate di un adattatore per puntali da centrifuga e lavare le perle tre volte con 200 microlitri di tampone IAP ghiacciato, seguito da tre lavaggi con acqua purificata ghiacciata.
Centrifugare le colonne a 200 x g per 2 minuti tra un lavaggio e l'altro, facendo attenzione a non lasciare che la colonna si asciughi. Dopo il lavaggio finale, eluire i peptidi con due cicli da 50 microlitri di TFA allo 0,15%. Dissalare i peptidi con una punta dello stadio C18 ed essiccarli con centrifugazione sottovuoto.