Estrazione basata sull'immunoaffinità di peptidi ubiquitinilati: una tecnica per estrarre selettivamente peptidi marcati con ubiquitina da frazioni peptidiche purificate
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Ricerca sul cancro
0 visualizzazioni • 4:00 min. • April 30th, 2023
L'ubiquitinazione delle proteine è caratterizzata dall'aggiunta di ubiquitina - una mini-proteina regolatrice - attraverso i suoi residui di diglicina ai residui di lisina della proteina substrato. Questo genera un legame lisina-glicina-glicina tra la proteina substrato e l'ubiquitina.
Per isolare i peptidi marcati con ubiquitina, inizia prendendo una miscela di peptidi.
Trattare questi peptidi con un cocktail di enzimi endonucleasi. Durante il trattamento, gli enzimi Lys-C e tripsina scindono efficacemente i peptidi ubiquitinilati sul residuo di arginina, dando luogo a frammenti peptidici contenenti un motivo caratteristico della diglicina.
Aggiungere questi frammenti di peptidi a un impasto di perle di idrogel coniugato con anticorpi.
Questi anticorpi contengono un sito di riconoscimento della di-glicina, che si lega esclusivamente ai peptidi ubiquitinilati, formando un complesso peptide-perlina.
Centrifuga per pellettizzare complessi peptidico-perline ubiquitinilate. Rimuovere il surnatante non legato contenente peptide non ubiquitinilato.
Caricare i complessi su un gruppo filtro. Centrifugare per rimuovere il tampone e intrappolare le perle coniugate con peptidi.
Aggiungere un
Visualizza la trascrizione completa e accedi a migliaia di video scientifici