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0 visualizzazioni • 3:07 min • April 30th, 2023
L'imaging intravitale attraverso finestre di imaging ottico facilita il tracciamento ad alta risoluzione delle singole cellule per studiare il loro comportamento nel microambiente nativo in un animale vivo.
Per iniziare, prendete un topo anestetizzato con il cervello pre-iniettato con cellule tumorali e con una finestra cranica impiantata che si inserisce all'interno di un anello di metallo. Le cellule tumorali esprimono proteine fluorescenti nucleari
.Posizionare il mouse, rivolto verso l'alto, in una scatola di imaging. Il supporto magnetico nella scatola di imaging aiuta a fissare la finestra cranica impiantata.
Ora, trasferisci la scatola di imaging all'interno della camera di imaging controllata dall'ambiente di un microscopio invertito per analizzare il comportamento delle cellule tumorali nel cervello.
In modalità multifotone, impostare il laser su una lunghezza d'onda adeguata. Concentrati sulla regione tumorale per rilevare la fluorescenza dalle cellule tumorali.
Definisci uno z-stack per ogni posizione per acquisire più immagini intravitali di cellule tumorali in diversi piani ottici.
Questo passaggio consente di catturare una percentuale significativa di cellule tumorali nel microambiente tumorale senza influire sulla risoluzione cellulare.
Successivamente, acquisire immagini da diverse posizioni del tumore per una durata prolungata.
Il tracciamento del percorso delle cellule tumorali su diversi piani ottici aiuta a determinare la migrazione delle singole cellule tumorali utilizzando un software adatto.
Al momento dell'esperimento appropriato, posizionare il mouse a faccia in su in una scatola di imaging e impostare l'obiettivo dell'acqua 25x sulla posizione z più bassa. Aggiungere una grossa goccia d'acqua all'obiettivo e trasferire la scatola di imaging nella camera climatica buia a 37 gradi Celsius del microscopio.
Portare l'obiettivo sul vetrino della finestra di imaging cranico fino a quando la goccia d'acqua tocca il vetrino e, utilizzando la modalità di epifluorescenza, osservare il tumore attraverso l'oculare per mettere a fuoco le cellule.
Sintonizzare il laser sulla lunghezza d'onda corretta e selezionare la modalità live. Dopo aver selezionato diverse posizioni di interesse per l'imaging, registrare le loro coordinate nel software. Definisci uno z-stack per ogni posizione per acquisire il volume massimo di cellule tumorali senza compromettere la risoluzione delle cellule tumorali, con la dimensione del passo tra le immagini impostata su 3 micrometri.
Quindi, acquisire immagini del volume del tumore in diverse posizioni ogni 20 minuti per 2 ore, aggiungendo acqua all'obiettivo prima di ogni acquisizione dell'immagine. Dopo aver acquisito l'ultima immagine, trasferire il mouse su un termoforo con monitoraggio fino al completo recupero.