Coltura di cellule endoteliali da microvasi cerebrali di ratto: una procedura per isolare e coltivare cellule endoteliali da microvasi di cervello di ratto

Per isolare le cellule endoteliali cerebrali, in primo luogo, trasferire un cervello di ratto raccolto in un piatto contenente tampone refrigerato.

Dopo aver rimosso il cervelletto e i nervi ottici, dividere il cervello in emisferi cerebrali. Quindi, separare il mesencefalo dal proencefalo.

Rimuovere le meningi e la sostanza bianca contenente mielina dal proencefalo, lasciando dietro di sé la corteccia cerebrale per isolare i microvasi.

Successivamente, omogeneizzare la corteccia per rompere il tessuto nervoso e i costituenti.

Centrifugare l'omogeneizzato per rimuovere i detriti cellulari e la mielina.

Successivamente, trattare il pellet di tessuto con un cocktail digestivo contenente collagenasi, dispasi ed enzimi desossiribonucleasi.

Le collagenasi e le dispasi digeriscono la matrice extracellulare che incorpora i microvasi, allentando i frammenti dei microvasi dal tessuto. Le desossiribonucleasi degradano il DNA libero rilasciato dalle cellule lisate.

Miscelare il volume desiderato dell'omogenato digerito con un mezzo di gradiente di densità appropriato e centrifugare.

Scartare lo strato superiore contenente la mielina e le cellule parenchimali cerebrali, seguito dal surnatante.

Ora, trattare il pellet contenente microvasi con il cocktail digestivo per rilasciare completamente i frammenti di microvasi che comprendono cellule endoteliali e periciti.

Centrifugare la sospensione. Risospendere il pellet contenente frammenti di microvasi in un terreno adatto integrato con puromicina, un antibiotico.

Seminare la sospensione in una piastra rivestita di proteine della matrice extracellulare e incubare.

I frammenti del microrecipiente aderiscono al rivestimento della piastra. La puromicina elimina selettivamente i periciti, mentre i componenti dei terreni facilitano la proliferazione delle cellule endoteliali.

Rimuovere il cervello dal cranio di tre ratti Wistar di 5 settimane e trasferire il cervello in una capsula di Petri riempita con tampone di dissezione freddo tenuto su ghiaccio.

Sezionare il cervello senza il cervelletto e i nervi ottici. Quindi, taglia ogni cervello a metà per separare i due emisferi cerebrali.

Sotto lo stereomicroscopio, fare un altro taglio per rimuovere il mesencefalo e trasferire tutti i proencefali in una capsula di Petri pulita su ghiaccio con tampone di dissezione.

Quindi, trasferire un proencefalo in una nuova capsula di Petri riempita con tampone di dissezione freddo. Tenerlo con la pinza e staccare con cura le meningi dai bordi del proencefalo.

Successivamente, capovolgi il proencefalo e rimuovi con cura le meningi senza strapparla. Assicurati che il proencefalo sia ripulito dalle meningi e taglia la parte rimanente dei nervi ottici. Lo scopo di questo passaggio è quello di rimuovere il piumone di sostanza bianca per ottenere un guscio di corteccia.

Inizia bloccando il proencefalo sul bordo e poi trascina con cura la pinza lungo la superficie, facendo attenzione a non strappare la superficie della corteccia.

Quindi, assicurati che il cervello sia libero dalle meningi ruotandolo per verificare che non ci siano meningi residue o grandi vasi superficiali.

Successivamente, a partire dall'estrazione dei tre cervelli dal cranio, il tempo pieno per la dissezione non dovrebbe richiedere più di 2 ore per la conservazione dei tessuti e la sopravvivenza delle cellule. Trasferire le cortecce di tre cervelli in 6 millilitri di tampone di dissezione fredda in un omogeneizzatore Dounce da 7 millilitri.

Successivamente, dissociare le cortecce con 10 colpi su e giù con il primo pestello di maggiore distanza, seguiti da 10 colpi su e giù con il secondo pestello di minore distanza.

Quindi, trasferire 6 millilitri di sospensione in una nuova provetta Falcon da 50 millilitri e lavare l'omogeneizzatore Dounce con 24 millilitri di tampone di dissezione a freddo. Dividi la sospensione in tre tubi Falcon per ottenere l'equivalente di una corteccia per tubo.

Successivamente, centrifugare a 1000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. L'osservazione del pellet mostra un gradiente di colore rosa, che rappresenta la parte microvascolare dell'omogeneizzato delle cortecce corte.

Ora, scartare il surnatante e omogeneizzare il pellet da una corteccia con 1 millilitro di soluzione enzimatica contenente un mix di collagenasi, dispasi, DNasi di tipo 1 e gentamicina.

Mettere le provette in uno shaker per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, mescolare 1 millilitro di digestato con 10 millilitri di BSA/HBSS 1X al 25% e agitare delicatamente i tubi. Successivamente, separarli mediante centrifugazione densità-dipendente a 3.600 x g per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione densità-dipendente, il pellet contiene i microvasi e il disco superiore contiene la mielina, il parenchima cerebrale e i microvasi residui.

Trasferire con cura il disco superiore e il surnatante in provette Falcon da 50 millilitri pulite; fare attenzione a non aspirare il pellet del microrecipiente.

Agitare delicatamente la provetta e ripetere la centrifugazione dipendente dalla densità. Durante questa seconda centrifugazione, mantenere il pellet risultante contenente i microrecipienti a 4 gradi Celsius.

Dopo la seconda centrifugazione densità-dipendente, scartare con cura il disco superiore e il surnatante. Mescolare e risospendere i pellet risultanti contenenti i microrecipienti di entrambe le centrifugazioni con 1 millilitro di HBSS 1X freddo.

Successivamente, lavare i microrecipienti con 20 millilitri di HBSS 1X freddo e centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti. Quindi, scartare il surnatante, facendo attenzione a non perdere il pellet del microrecipiente.

Omogeneizzare il pellet di microvaso da una corteccia con 1 millilitro della stessa soluzione enzimatica seguendo un leggero vortice dei tubi. Inoltre, digerire i microrecipienti per 1 ora a 37 gradi Celsius in uno shaker. Successivamente, mescola i microvasi digeriti dalle tre cortecce in una provetta.

Anche in questo caso, separare la miscela in due provette Falcon da 50 millilitri per ottenere i microvasi estratti dall'equivalente di una corteccia e mezza per provetta. Quindi, centrifugare a 1.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.

Poco prima di placcare i microrecipienti, prelevare due palloni T75 rivestiti dall'incubatrice e aspirare l'eccesso di rivestimento. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di microvasi in 1 millilitro di ECM.

Portare ogni provetta a 10 millilitri con ECM integrata con 4 microgrammi per millilitro di puromicina per avviare il processo di purificazione e impiattare i microvasi nel pallone.

Quindi, metti i palloni nell'incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per consentire l'adesione dei microvasi alla matrice di collagene-fibronectina.