Saggio di migrazione delle cellule staminali del tumore cerebrale (BTSC) per studi di trattamento farmacologico: una tecnica di imaging in vitro di cellule vive per analizzare l'effetto del trattamento farmacologico sulla migrazione delle BTSC

Le cellule staminali tumorali cerebrali o BTSC, una sottopopolazione di cellule tumorali cerebrali, possono avviare la crescita e la metastasi del tumore, rendendole bersagli promettenti per la terapia del cancro. Per studiare l'effetto dei farmaci sulla migrazione di BTSC in vitro, in primo luogo, preparare sospensioni uniformi di BTSC in un terreno adatto. Trattare una delle sospensioni con il farmaco di interesse.

Nel frattempo, ottenere una piastra per chemiotassi a più pozzetti costituita da inserti membranosi che separano ciascun pozzetto nelle camere superiore e inferiore. Pipettare la proteina della matrice extracellulare desiderata nelle camere inferiori e negli inserti membranosi. Incubare per facilitare la polimerizzazione della proteina.

Aggiungere un terreno basale adatto contenente il chemioattrattivo desiderato nelle camere inferiori e posizionarlo sopra gli inserti membranosi. Quindi, seminare la sospensione di BTSC trattata con il farmaco e non trattata in inserti membranosi. Visualizzare la lastra per una durata prolungata utilizzando la microscopia su cellule vive.

In coltura, le BTSC aderiscono alla matrice proteica dell'inserto. In risposta al gradiente di concentrazione di chemioattrattivi stabilito tra la camera superiore e quella inferiore, le BTSC non trattate migrano attraverso la matrice proteica attraverso i pori dell'inserto della membrana fino alla camera inferiore.

Tuttavia, il trattamento farmacologico influisce negativamente sull'attività funzionale delle cellule, diminuendo la migrazione delle BTSC. Ora, utilizzando un software adatto, analizza e quantifica le BTSC migrate nelle camere inferiori. Le BTSC non trattate mostrano una migrazione aumentata, mentre le BTSC trattate con farmaci mostrano una migrazione ridotta.

Per valutare gli effetti di un trattamento farmacologico di interesse sulla migrazione, in primo luogo, pretrattare le cellule con la concentrazione appropriata del farmaco per un adeguato periodo sperimentale. Per preparare la piastra per chemiotassi, rivestire tre pozzetti con inserto a membrana e tre pozzetti con serbatoio inferiore per condizione di una piastra per chemiotassi a 96 pozzetti con 75 e 225 microlitri di 0,2 milligrammi per millilitro di collagene di tipo I, rispettivamente, per 1 ora a 37 gradi Celsius.

Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di collagene da ciascun pozzetto senza graffiare il rivestimento di collagene e lavare i pozzetti due volte con PBS sterile. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere l'inserto dalla piastra e aggiungere 225 microlitri di terreno privo di fattore di crescita integrato con il 10% di FBS a ciascun pozzetto del serbatoio inferiore della piastra per chemiotassi.

Quindi, riposizionare delicatamente l'inserto superiore nel serbatoio inferiore inclinandolo per evitare la formazione di bolle e aggiungere 2,5 volte 10 al terzo BTSC dissociato in 50 microlitri di terreno privo di fattore di crescita in ciascun pozzetto dell'inserto. È importante dissociare completamente le BTSC in singole cellule e contarle attentamente prima della placcatura per evitare di avere grumi di cellule o troppe cellule nell'inserto superiore.

Per visualizzare la migrazione BTSC lungo il gradiente FBS, posizionare la piastra in un sistema di imaging di cellule vive e impostare il software di imaging automatizzato per acquisire immagini microscopiche della piastra ogni 1 o 2 ore per un massimo di 72 ore. Al termine dell'acquisizione dell'immagine, selezionare una nuova definizione di elaborazione per distinguere le BTSC dai loro pori di inserimento sul lato inferiore della membrana, modificando l'analisi se non distingue accuratamente le cellule dalla membrana di fondo come necessario.

Per quantificare le cellule che sono migrate attraverso i pori, raccogliere i dati come area della superficie cellulare sul lato inferiore della membrana per ciascuno dei tre pozzetti di replicazione per condizione. Quindi, rappresenta graficamente la migrazione cellulare come l'area delle cellule migrate in micrometri al quadrato nel tempo.