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0 visualizzazioni • 4:32 min. • July 8th, 2025
Le cellule staminali tumorali cerebrali o BTSC, un sottoinsieme di cellule all'interno dei tumori cerebrali, possiedono capacità di autorinnovamento e contribuiscono alla progressione del tumore e alla resistenza alla terapia. Per determinare l'effetto dei farmaci sull'invasione di BTSC in vitro, iniziare con le sospensioni di BTSC in un terreno adatto in fiasche di coltura. Trattare una delle sospensioni con il farmaco di interesse.
Incubare i flaconi. I componenti del terreno promuovono la proliferazione cellulare. Le cellule rimangono in sospensione, formando così ammassi sferici chiamati neurosfere. Al raggiungimento della dimensione desiderata, raccogliere le neurosfere. Lasciali sedimentare per gravità e rimuovi i substrati. Quindi, risospendere le neurosfere non trattate e trattate con il farmaco in un terreno refrigerato contenente una proteina della matrice extracellulare adatta e il farmaco.
Piastra le sospensioni in una piastra a più pozzetti raffreddata. Lasciare che le neurosfere sedimentino sul fondo del pozzetto per un migliore imaging. Successivamente, incubare per la polimerizzazione delle proteine della matrice, incorporando le neurosfere all'interno. Immagini delle neurosfere per una durata prolungata utilizzando la microscopia su cellule vive. In coltura, le BTSC incorporate secernono enzimi proteolitici, che degradano le proteine della matrice, consentendo la migrazione cellulare.
Nel tempo, l'aumento della degradazione della matrice crea un microambiente appropriato per l'invasione di BTSC dalle neurosfere alla matrice circostante. Utilizzando un software adatto, misurare la superficie totale delle neurosfere in diversi punti temporali. Le BTSC non trattate mostrano una maggiore superficie, indicando un aumento del tasso di invasione rispetto alle BTSC trattate con farmaci.
Per valutare l'invasione della neurosfera BTSC, in primo luogo, aggiungere il composto di interesse al pallone alla concentrazione desiderata per il corso temporale predeterminato prima della placcatura dell'invasione della neurosfera. Quando la dimensione media della neurosfera raggiunge circa 150-200 micrometri, puntare e mescolare delicatamente il pallone con una pipetta e trasferire 500 microlitri di neurosfere BTSC risospese in una provetta da 1,5 millilitri per condizione sperimentale su ghiaccio.
Aspirare il più possibile il terreno dal fondo di ogni provetta da 1,5 millilitri senza perdere il pellet di neurosfera e risospendere delicatamente le neurosfere in 500 microlitri di soluzione di collagene di tipo I da 0,4 milligrammi per millilitro appena preparata. Trasferire 100 microlitri di neurosfere di collagene sospese in tre pozzetti per condizione in una nuova piastra da 96 pozzetti su ghiaccio e lasciare che le neurosfere si stabilizzino per 5 minuti.
È fondamentale lasciare che le neurosfere si depositino per 5 minuti sul ghiaccio. In caso contrario, le sfere non saranno sullo stesso piano di messa a fuoco per l'imaging. Dopo 5 minuti di polimerizzazione del collagene nell'incubatore per colture cellulari, trasferire la piastra nel vassoio del sistema di imaging di cellule vive per acquisire un'immagine di riferimento delle dimensioni della neurosfera al momento della placcatura prima dell'inizio dell'invasione. Quindi, impostare il software in modo che acquisisca immagini ogni 1 o 2 ore fino a quando il tasso di invasione non si è stabilizzato, in genere entro 24 ore.
Per visualizzare l'aumento della superficie delle BTSC mentre invadono la matrice nel tempo, utilizzare l'obiettivo 10x per acquisire quattro immagini per pozzetto per ogni serie di tre pozzetti replicati. Per determinare l'area relativa della superficie cellulare rappresentata come percentuale di confluenza del pozzetto, impostare una definizione di elaborazione che evidenzi in modo specifico le celle sullo sfondo del pozzetto. Quindi, raccogli i dati come superficie totale della cella per ogni pozzetto in ogni punto temporale. Determina la media dei tre pozzetti replicati e rappresenta graficamente l'invasione delle BTSC tracciando l'aumento dell'area cellulare nel tempo.