Trapianto ortotopico a lungo termine di cellule tumorali in embrioni di zebrafish: un metodo efficiente per fornire cellule tumorali nel quarto ventricolo di embrioni di zebrafish per l'analisi a lungo termine del comportamento delle cellule tumorali

Durante il trapianto ortotopico, le cellule tumorali o il tessuto di un donatore portatore di tumore vengono trapiantati nel tessuto corrispondente di un ricevente della stessa specie. In primo luogo, preparare una sospensione uniforme - in un tampone adatto - di cellule tumorali cerebrali marcate in fluorescenza raccolte da un pesce zebra portatore di tumore. Utilizzando una punta di caricamento in gel fine, caricare questa sospensione cellulare in un ago per microiniezione.

Quindi, fissare l'ago caricato nel supporto di un micromanipolatore. Successivamente, trasferire un embrione di zebrafish anestetizzato su una piastra di iniezione prefabbricata. Per un facile accesso durante la microiniezione, posizionare l'embrione lateralmente per visualizzare i ventricoli cerebrali, una rete di cavità piene di liquido cerebrospinale all'interno del cervello.

Regolare la punta dell'ago per iniettare la sospensione di cellule tumorali nel quarto ventricolo, la cavità a forma di diamante del rombencefalo dell'embrione. Le cellule tumorali occupano lo spazio vuoto all'interno del ventricolo. Ritrarre l'ago. Trasferire l'embrione in una piastra di coltura contenente soluzione fisiologica. Osservare l'embrione sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza per confermare la presenza di cellule tumorali all'interno dello spazio ventricolare.

Incubare l'embrione. Entro poche ore dall'iniezione, le cellule tumorali migrano e invadono il tessuto cerebrale circostante, dove poi proliferano dando origine a nuovi tumori. Nel tempo, le cellule tumorali proliferano e invadono ulteriormente, diffondendosi in tutto il cervello.

Utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire da 10 a 20 embrioni anestetizzati alla periferia della piastra di iniezione. Gli embrioni dovrebbero cadere lateralmente con i ventricoli chiaramente visibili e accessibili. Utilizzare una sonda angolata per regolare gli embrioni secondo necessità e posizionarli lontano dal bordo esterno della piastra di iniezione.

Quindi, utilizzare una punta di caricamento del gel per caricare da 1 a 2 microlitri della sospensione di cellule tumorali nell'ago per iniezione e inserire l'ago nel manipolatore. Quindi, abbassare manualmente il manipolatore, tenendo l'ago a un angolo di 45 gradi. Regolare le manopole del micromanipolatore nelle direzioni x, y e z fino a quando l'ago non si trova appena sopra e a circa 5 millimetri a destra della testa dell'embrione.

Utilizzando uno stereomicroscopio, regolare lentamente il micromanipolatore in direzione x fino a quando l'ago non perfora il quarto ventricolo dell'embrione. Non permettere all'ago di perforare il cuore o il tuorlo. Per iniezioni coerenti, gli embrioni devono essere anestetizzati. Il tumore deve essere adeguatamente dissociato in una sospensione cellulare e l'ago deve perforare il quarto ventricolo ma non estendersi oltre il cuore.

Premere il pedale del microiniettore per iniettare la sospensione delle cellule tumorali. Al termine dell'iniezione, utilizzare acqua fresca d'uovo per sciacquare delicatamente gli embrioni iniettati dalla piastra di iniezione e in una capsula di Petri. Ora, ispeziona gli embrioni iniettati con uno stereomicroscopio a fluorescenza in una stanza buia. Verificare che la pressione di iniezione, l'angolo, le dimensioni dell'ago e la viscosità della sospensione cellulare portino le cellule tumorali a riempire dal 25% al 50% dello spazio ventricolare.

Rimetti gli embrioni nell'incubatrice a 28 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, valutare la sopravvivenza dell'embrione esaminando le caratteristiche morfologiche e fisiologiche, come il normale sviluppo del cuore e del cervello, come descritto in precedenza.