Elettroporazione ex vivo di fette cerebellari di embrioni di pollo: un metodo per introdurre il DNA plasmidico che codifica la proteina fluorescente verde per visualizzare lo sviluppo delle cellule granulari

Le cellule dei granuli cerebellari sono il tipo di neuroni più abbondante nel cervello. Lo strato granulare esterno, EGL, è composto esclusivamente da precursori cellulari granulari, GCP, che si differenziano e migrano verso l'interno per formare lo strato granulare interno, IGL.

Per visualizzare lo sviluppo delle cellule granulari, preparare una camera di elettroporazione collegando un anodo alla base di una piastra di Petri. Aggiungere il terreno di coltura per coprire l'elettrodo. A questo punto, posizionare un inserto di coltura sull'elettrodo ricoperto di terreno. Trasferire le fette di cervelletto dell'embrione di pollo sull'inserto di coltura con orientamento sagittale.

Il piano sagittale consente di identificare lo strato bersaglio-EGL rispetto a diversi strati del cervelletto. Aggiungere una soluzione colorante viscosa contenente un DNA plasmidico GFP su EGL. Il DNA plasmidico GFP codifica per una proteina fluorescente verde che si distribuisce in modo omogeneo all'interno del citoplasma cellulare e consente l'imaging di cellule vive.

Quindi, posizionare un catodo nel mezzo vicino all'EGL ma non direttamente sul tessuto. Quindi, applicare più impulsi elettrici a diverse regioni EGL. Gli impulsi elettrici inducono pori temporanei nella membrana cellulare, consentendo alle cellule di assorbire il DNA plasmidico. Successivamente, il DNA plasmidico consente l'espressione di GFP nelle cellule granulari.

Visualizzare le fette cerebellari al microscopio a fluorescenza per osservare la differenziazione e il modello di migrazione delle cellule granulari in diverse fasi dello sviluppo cellulare.

Costruire una camera di elettroporazione fissando l'anodo di un elettroporatore alla base di una piastra di Petri da 60 millimetri utilizzando del nastro isolante. Aggiungere circa 1 millilitro di HBSS per coprire l'elettrodo. Quindi, posizionare un inserto di coltura da 0,4 micrometri sopra l'elettrodo ricoperto di HBSS.

Utilizzare una pipetta Pasteur da 3 millilitri con punta tagliata per trasferire le fette identificate, fino a 5 per inserto sull'inserto di coltura. Quindi, separare le fette e lasciarle depositare sull'inserto di coltura con orientamento sagittale. Usando una pipetta, rimuovere il terreno in eccesso dalle fette di cervello. Lasciare che l'inserto poggi sull'elettrodo in modo che vi sia contatto tra l'inserto e l'elettrodo.

In questa configurazione, l'inserto di coltura con le fette poggerà sulla superficie del mezzo, mantenendo il circuito ma consentendo il targeting spaziale del catodo. Utilizzando un puntale per pipetta P10, pipettare 5 microlitri di DNA diluito con il 20% di Fast Green sulla superficie di una regione mirata di ciascuna fetta. L'aggiunta di Fast Green assicura che la soluzione di DNA sia sufficientemente viscosa da impedire un'ampia dispersione del DNA.

Quindi, posizionare il catodo sul tessuto mirato desiderato ed elettroporare i campioni. Evitare il contatto diretto del catodo con il tessuto posizionando il catodo il più vicino possibile al tessuto senza toccarlo effettivamente. Ripetere l'elettroporazione in più regioni dello strato granulare esterno su ogni singola fetta cerebellare come desiderato.

Al termine, trasferire l'inserto di coltura in una capsula di Petri da 30 millimetri. A ciascuna coltura, aggiungere 1 millilitro di terreno di coltura preriscaldato sotto l'inserto di coltura. Assicurarsi che l'inserto non galleggi sul fluido. L'inserto di coltura deve essere a contatto con il terreno, ma le fette non devono essere immerse in esso.