Editing del genoma basato sulla nucleasi a dita di zinco: una tecnica per modificare il genoma nelle cellule staminali pluripotenti umane mediante meccanismo di riparazione dipendente dall'omologia a doppio filamento
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 6:34 min. • July 8th, 2025
La nucleasi a dita di zinco o ZFN contiene un macrodominio stabilizzato con ioni di zinco, che lega il DNA, collegato a un dominio endonucleasico tramite un linker. Questa struttura aiuta a mantenere la specificità durante il taglio del DNA.
Per utilizzare le ZFN per l'editing del genoma, è necessario prendere una coltura di cellule staminali pluripotenti umane. Integralo con un plasmide che codifica ZFN. Aggiungere un plasmide di riparazione contenente il gene bersaglio e il gene di resistenza agli antibiotici inserito tra bracci di omologia o HA. Elettroporare la miscela cellula-DNA dove la corrente elettrica facilita l'ingresso dei plasmidi all'interno della cellula.
Una volta all'interno, i motivi a dita di zinco di ZFN tradotto si legano alle triplette di coppie di basi complementari nel genoma ospite, posizionando correttamente l'endonucleasi di restrizione Fok-1 nel sito bersaglio. Gli ZFN si legano a filamenti opposti in coppie, consentendo all'omodimerizzazione di Fok-1 di formare un centro catalitico attivo in cui Fok-1 genera rotture a doppio filamento di DNA o DSB, producendo un eccesso di quattro nucleotidi.
La presenza di HA nel plasmide di riparazione guida la ripara
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