Editing del genoma basato sulla nucleasi a dita di zinco: una tecnica per modificare il genoma nelle cellule staminali pluripotenti umane mediante meccanismo di riparazione dipendente dall'omologia a doppio filamento

La nucleasi a dita di zinco o ZFN contiene un macrodominio stabilizzato con ioni di zinco, che lega il DNA, collegato a un dominio endonucleasico tramite un linker. Questa struttura aiuta a mantenere la specificità durante il taglio del DNA.

Per utilizzare le ZFN per l'editing del genoma, è necessario prendere una coltura di cellule staminali pluripotenti umane. Integralo con un plasmide che codifica ZFN. Aggiungere un plasmide di riparazione contenente il gene bersaglio e il gene di resistenza agli antibiotici inserito tra bracci di omologia o HA. Elettroporare la miscela cellula-DNA dove la corrente elettrica facilita l'ingresso dei plasmidi all'interno della cellula.

Una volta all'interno, i motivi a dita di zinco di ZFN tradotto si legano alle triplette di coppie di basi complementari nel genoma ospite, posizionando correttamente l'endonucleasi di restrizione Fok-1 nel sito bersaglio. Gli ZFN si legano a filamenti opposti in coppie, consentendo all'omodimerizzazione di Fok-1 di formare un centro catalitico attivo in cui Fok-1 genera rotture a doppio filamento di DNA o DSB, producendo un eccesso di quattro nucleotidi.

La presenza di HA nel plasmide di riparazione guida la riparazione omologico-dipendente in cui l'estremità sporgente si inverte e utilizza la sequenza HA omologa come modello. La sintesi del DNA continua con l'aggiunta di nucleotidi complementari al gene bersaglio.

Le lacune risultanti vengono legate, facilitando l'inserimento genico. Inoltre, il gene della resistenza agli antibiotici senza promotore è espresso da un promotore ospite a monte del sito di inserimento. Le cellule modificate con successo crescono nel terreno di selezione antibiotico.

Inizia coltivando cellule staminali pluripotenti umane in terreni hESC su una piastra a 6 pozzetti contenente fibroblasti embrionali di topo inattivati con mitomicina C, o MEF, cellule alimentatrici coltivate su gelatina. Ogni giorno successivo dopo la piastratura, fino a quando l'hPSC non ha raggiunto il 50% di confluenza, utilizzare una pipetta di vetro e aspirare per rimuovere l'intero volume di terreno. Sostituire con 3 millilitri di terreno hESC caldo per pozzetto.

Un giorno prima del targeting, rimuovere il terreno hESC e aggiungere un terreno hESC fresco e preriscaldato integrato con 10 micromolari Y27632. Inoltre, preparare una o due piastre a 6 pozzetti di cellule alimentatrici MEF resistenti ai farmaci da topi DR4. Il giorno del targeting, preparare le soluzioni di trasfezione pipettando 5 microgrammi di plasmidi di espressione della nucleasi a dita di zinco 1 e 2 in una provetta da 1,5 millilitri.

Aggiungere 30 microgrammi di plasmide donatore di riparazione, seguiti da una quantità sufficiente di soluzione salina tamponata con fosfato 1X per portare il volume a 300 microlitri. Ispezionare le cellule al microscopio per garantire una confluenza del 50%. Quindi, utilizzare una pipetta di vetro e aspirare per rimuovere il terreno dalla piastra delle hPSC. Quindi, lavare le cellule con 2 millilitri di 1X PBS caldo. Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere 0,5 millilitri di soluzione di tripsina EDTA allo 0,25%, direttamente sulle cellule.

Posizionare nell'incubatore per colture tissutali per circa 10 minuti, o fino a quando lo strato di alimentazione inizia a sollevarsi dalla piastra. Dopo l'incubazione, aggiungere 2 millilitri di terreno esWash caldo a ciascun pozzetto per fermare la reazione della tripsina. Raccogli le cellule da ogni pozzetto, assicurandoti che le celle di alimentazione si stacchino come un foglio. Pipettare il contenuto di ciascun pozzetto in un'unica provetta conica da 50 millilitri, unendo tutti i pozzetti, e triturare le cellule utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri.

Aggiungere il terreno esWash per portare la sospensione cellulare a 40 millilitri. Attendere uno o due minuti per consentire ai pezzi di alimentazione di depositarsi sul fondo della provetta, quindi rimuovere il surnatante utilizzando una pipetta sierologica e depositarlo in una nuova provetta conica da 50 millilitri. Dopo aver centrifugato la sospensione cellulare per cinque minuti a 190 x g, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere le cellule in 500 microlitri di 1X PBS.

Combinare le cellule risospese con la soluzione di trasfezione al plasma preparata in precedenza. Pipettare le cellule e la miscela di trasfezione in una cuvetta per elettroporazione da 4 millimetri e metterle sul ghiaccio per tre-cinque minuti. Impostare i parametri per il programma esponenziale sul sistema di elettroporazione a 250 volt, 500 microFarad, resistenza infinita e dimensione della cuvetta di 4 millimetri. Elettroricaricare le cellule, quindi riposizionare la cuvetta sul ghiaccio per tre minuti.

Risospendere le cellule elettroporate in 18 millilitri di terreno hESC caldo integrato con 10 micromolari Y27632. Ispezionare i MEF DR4 al microscopio. Piastra 3 millilitri di sospensione a cellula singola in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti contenente cellule feeder DR4 e rimettila nell'incubatore. Il terzo giorno dopo la placcatura, sostituire il terreno sulle celle con un terreno hESC senza Y27632. Il giorno 4, sostituire i terreni non integrati con terreni contenenti l'antibiotico di selezione appropriato. Qui viene utilizzata la puromicina.