Caricamento di microsfere per introdurre acidi nucleici in cellule coltivate aderenti: una tecnica per caricare plasmidi codificanti proteine fluorescenti in cellule di mammifero aderenti

Inizia con una coltura di cellule di mammifero aderenti in una piastra di coltura. Trasferisci le perle di vetro sterilizzate trattate con alcali, di dimensioni micron, nella camera di un caricatore di perle personalizzato. Coprire l'apertura della camera utilizzando una rete con aperture di dimensioni ottimali per consentire il passaggio delle perle durante il caricamento. Fissare la rete con un gruppo camera di imaging.

Rimuovere il supporto dalla piastra. Pipettare una sospensione di DNA plasmidico codificante la proteina reporter fluorescente nella piastra per una distribuzione uniforme sulle cellule. Utilizzando l'apparato caricatore di perline, disperdere delicatamente un monostrato di perle di vetro sulle celle. Picchiettare brevemente la piastra di coltura con forza adeguata.

Le perle di vetro rotolano brevemente sopra le celle aderenti, mentre il trattamento alcalino le rende meno aderenti alle cellule. L'impatto delle collisioni tra le perle e le cellule trasmette una deformazione adeguata creando interruzioni localizzate nelle membrane cellulari. Questi pori transitori formati di piccole dimensioni facilitano l'assorbimento del DNA plasmidico nelle cellule, impedendo l'ingresso di grandi sfere.

Durante il periodo di recupero, la membrana cellulare si richiude, ripristinando l'integrità della membrana e intrappolando il DNA plasmidico. Aggiungere il terreno alla piastra e aspirare con cura eventuali perle galleggianti visibili dalla piastra. Incubare la piastra.

Le cellule trasfettate con successo contenenti DNA plasmidico esprimono le proteine reporter fluorescenti, che possono essere visualizzate al microscopio a fluorescenza.

Rimuovere il terreno dalle celle e aspirare delicatamente tutto il terreno intorno ai bordi della camera. Quindi, inclinare la camera con un angolo di circa 45 gradi e rimuovere la goccia rimanente di terreno nel micropozzetto centrale. Pipettare delicatamente la soluzione di caricamento delle microsfere sul micropozzetto di vetro presente al centro della camera.

Utilizzare l'apparato di caricamento delle perle per disperdere delicatamente un monostrato di perle di vetro sulla parte superiore delle celle. Assicurarsi che le perline coprano completamente le celle. Pizzicare la camera con due dita. Sollevalo di circa due pollici e abbassalo con decisione usando una forza approssimativamente equivalente a far cadere il piatto da quell'altezza.

Reinserire delicatamente il fluido nella camera pipettandolo lentamente sul lato in plastica della camera. Aspirare eventuali perle galleggianti senza disturbare le cellule. L'intera procedura di caricamento del cordone deve essere eseguita in tempi relativamente brevi, in modo che le celle non si secchino quando sono prive di mezzo. Quindi, incubare le cellule per 0,5-2 ore nell'incubatore.