JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:12 min. • July 8th, 2025
Per microiniettare il DNA esogeno nell'embrione di Anopheles, prendere il numero desiderato di uova di zanzara pre-blastoderma appena raccolte. In questa fase iniziale dello sviluppo, l'ovulo contiene nuclei senza formare strutture cellulari.
Posizionare le uova a forma di barchetta alla periferia di una carta assorbente umida presente sulla superficie di un vetrino. Questa fase garantisce un'adeguata idratazione dell'embrione per facilitare l'iniezione nelle fasi successive. Allineare le uova adiacenti l'una all'altra con la superficie ventrale esposta verso l'esterno.
Ora, prendi un ago per microiniezione a foro stretto contenente la soluzione plasmidica desiderata. Utilizzare un microscopio da dissezione per posizionare l'ago vicino al polo posteriore dell'uovo, un sito per i precursori delle cellule germinali. Inserire l'ago con un'angolazione appropriata che fori l'esocorion - lo strato esterno - e l'endocorion - uno strato interno del guscio d'uovo - raggiungendo infine l'embrione.
Iniettare la miscela plasmidica nel tuorlo dell'embrione. Ritrarre delicatamente l'ago e lasciare che le uova crescano in condizioni adeguate. Man mano che l'ovulo cresce, alcuni nuclei migrano verso il polo posteriore, dove possono incorporare il DNA microiniettato. Questi nuclei diventano in seguito gameti, le cellule sessuali che possono provocare mutazioni germinali ereditabili.
Visualizzare le zanzare adulte per il fenotipo trasformato - le caratteristiche osservabili nelle generazioni successive confermano il successo della microiniezione.
Utilizzare una punta di micro-caricatore per riempire gli aghi con due microlitri di miscela di DNA. Inserire l'ago nel portaago e collegare il tubo della pompa a pressione automatizzata. Allineare l'ago in modo che formi un angolo di 15 gradi con il piano del vetrino.
Aprire la punta dell'ago toccando con cautela il primo uovo. Quindi, inserire la punta dell'ago a circa 10 micrometri nel polo posteriore. Un'iniezione riuscita porterà a un piccolo movimento del citoplasma all'interno dell'ovulo.
Utilizzare i controlli del tavolino coassiale del microscopio per passare all'uovo successivo e continuare l'iniezione. Per assicurarsi che la punta dell'ago rimanga aperta e non sia ostruita, premere il pulsante "Inietta" prima di inserire un altro embrione e visualizzare la piccola gocciolina all'apertura dell'ago. Se l'ago si ostruisce, premere il pulsante "Cancella" per eliminare l'ago e ripetere il test di visualizzazione delle goccioline.
Regolare la pressione secondo necessità, se l'apertura della punta dell'ago diventa leggermente più grande per garantire che la dimensione della goccia rimanga piccola. Iniettare circa 40-50 uova con un ago. Al termine delle iniezioni, sciacquare le uova in un contenitore di vetro rivestito di carta da filtro e riempito con 50 millilitri di acqua deionizzata.