Cromatografia a scambio cationico: una tecnica per isolare la proteina ricombinante bersaglio dal lisato di cellule di insetto basata sulla carica superficiale netta

La cromatografia a scambio cationico facilita la separazione delle proteine dalle miscele in base alla loro carica superficiale netta.

Per l'isolamento della proteina del trasduttore del segnale target dal lisato proteico delle cellule di insetto, ottenere un lisato proteico target dializzato contenente altre proteine contaminanti. Aggiungere un tampone contenente cloruro di sodio per ridurre la viscosità del lisato e migliorare la solubilità delle proteine, aiutando a prevenire l'intasamento della colonna cromatografica durante la corsa.

Inoltre, il pH tampone al di sotto del punto isoelettrico della proteina bersaglio, pI, in cui la proteina ha carica netta zero, facilita il legame degli ioni idrogeno in eccesso ai gruppi carbossilati negativi, rendendo la proteina bersaglio carica positivamente.

Assemblare la colonna cromatografica contenente perle di agarosio reticolate accoppiate a gruppi caricati negativamente. Aggiungere un tampone legante per equilibrare la colonna e massimizzare le interazioni colonna-proteina. Caricare il lisato diluito sulla colonna bilanciata.

Le proteine bersaglio con carica positiva interagiscono e si legano strettamente ai gruppi caricati negativamente della colonna rispetto alle proteine contaminanti con carica meno positiva.

Lavare la colonna con il tampone per rimuovere le proteine contaminanti non legate e caricate negativamente. Successivamente, passare il tampone di eluizione, aumentando gradualmente la sua forza ionica.

A bassa forza ionica, c'è una competizione minima tra gli ioni positivi e le proteine per i gruppi negativi nella colonna, eluendo proteine contaminanti debolmente legate e meno caricate positivamente. Tuttavia, all'aumentare della forza ionica, gli ioni salino competono con le proteine del trasduttore del segnale bersaglio strettamente legate e riducono le interazioni tra le proteine e la colonna, eluendole come frazione purificata.

Preparare una colonna a scambio cationico da 20 millilitri lavandola con tre volumi di colonna di Buffer G, quindi con tre volumi di Buffer F. Successivamente, diluire 20 millilitri del campione dializzato fino a una concentrazione finale di cloruro di sodio di 100 millimolari, aggiungendo 20 millilitri di tampone E, e applicare il campione alla colonna di scambio.

È fondamentale diluire la piccola quantità del campione invece di tutto in una volta e i campioni diluiti devono essere applicati alla colonna immediatamente dopo la diluizione per limitare la precipitazione della proteina.

Continuare a caricare la colonna con il campione appena diluito man mano che la diluizione precedente si avvicina alla fine del carico. Quindi, lavare la colonna fino all'assorbanza basale 280 con il tampone F, che in genere richiedeva tre volumi di colonna.

Eluire la proteina dalla colonna con un gradiente di 400 millilitri dal tampone F al 65% del tampone G, raccogliendo l'eluato in frazioni di 6 millilitri. Una volta completato il gradiente, continuare a lavare la colonna per ulteriori 1,5 volumi di colonna con il 65% di buffer G.