Cromatografia a scambio cationico: una tecnica per isolare la proteina ricombinante bersaglio dal lisato di cellule di insetto basata sulla carica superficiale netta
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 3:33 min. • July 8th, 2025
La cromatografia a scambio cationico facilita la separazione delle proteine dalle miscele in base alla loro carica superficiale netta.
Per l'isolamento della proteina del trasduttore del segnale target dal lisato proteico delle cellule di insetto, ottenere un lisato proteico target dializzato contenente altre proteine contaminanti. Aggiungere un tampone contenente cloruro di sodio per ridurre la viscosità del lisato e migliorare la solubilità delle proteine, aiutando a prevenire l'intasamento della colonna cromatografica durante la corsa.
Inoltre, il pH tampone al di sotto del punto isoelettrico della proteina bersaglio, pI, in cui la proteina ha carica netta zero, facilita il legame degli ioni idrogeno in eccesso ai gruppi carbossilati negativi, rendendo la proteina bersaglio carica positivamente.
Assemblare la colonna cromatografica contenente perle di agarosio reticolate accoppiate a gruppi caricati negativamente. Aggiungere un tampone legante per equilibrare la colonna e massimizzare le interazioni colonna-proteina. Caricare il lisato diluito sulla colonna bilanciata.
Le proteine bersaglio con carica positiva interagiscono e si legano strettamente ai gruppi caricati negativamen
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