Saggio dell'attività enzimatica basato sulla cromatografia su strato sottile: una tecnica per determinare l'attività della pirofosfochinasi in vitro utilizzando la cromatografia su strato sottile

La pirofosfochinasi catalizza il trasferimento del difosfato o del pirofosfato dal precursore nucleotidico, come l'adenosina trifosfato, ATP, al substrato come la guanosina difosfato, GDP. Questo forma la guanosina tetrafosfato, un'importante molecola di segnalazione.

Per determinare l'attività della pirofosfochinasi, preparare una miscela di reazione comprendente GDP e ATP radiomarcati in un tampone adatto integrato con cloruro di magnesio. Aggiungere la quantità desiderata di pirofosfochinasi alla miscela di reazione e incubare.

Nel corso del tempo, in presenza di ioni magnesio, la pirofosfochinasi inizia a trasferire la frazione pirofosfato radiomarcata dall'ATP al GDP, producendo guanosina tetrafosfato radioattiva.

Ora, prendete una cromatografia su strato sottile o TLC, piastra prerivestita con polietilenimmina-cellulosa, una fase stazionaria a base di polimeri cationici. Individuare le aliquote degli analiti della miscela di reazione vicino alla base della piastra TLC in diversi punti temporali per arrestare la reazione e valutare i progressi.

Immergere la piastra in una camera di vetro contenente fosfato di potassio monobasico, un solvente in fase mobile. Quando il fronte del solvente si sposta verso l'alto, gli analiti caricati negativamente iniziano a migrare in base alle loro affinità con la fase stazionaria caricata positivamente.

Le differenze nelle cariche negative e nel peso degli analiti diversamente fosforilati determinano la loro migrazione relativa sulla piastra TLC, consentendo loro di immobilizzarsi come bande distinte.

Quando il fronte del solvente raggiunge la distanza desiderata, rimuovere la piastra e asciugare all'aria. Misurare l'intensità del segnale radioattivo, corrispondente alla deplezione di ATP marcata radioattivamente e all'accumulo di guanosina tetrafosfato per analizzare l'attività della pirofosfochinasi.

Prima di eseguire la reazione, preparare le piastre per cromatografia su strato sottile di cellulosa PEI lavandole in acqua deionizzata. Porre le piastre in una camera di vetro con acqua distillata doppia, ad una profondità di circa 0,5 centimetri. Dopo aver lasciato che l'acqua migri verso la parte superiore della piastra, estrarre le piastre dalla camera di vetro e lasciarle asciugare su una griglia da banco per una notte.

Segna le lastre asciutte a 2 centimetri da un bordo con una matita morbida, per indicare dove verranno applicati i campioni per TLC. Per campioni da 2 microlitri, applicare campioni a una distanza non inferiore a 1 centimetro l'uno dall'altro. Quando si pianificano gli esperimenti, lasciare sempre inutilizzato un punto su ogni piastra, che funga da corsia vuota per la quantificazione del campione.

Per eseguire il test di attività enzimatica, preparare le reazioni individuali utilizzando ^γ-32P-ATP, come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere l'RSH dopo che gli altri componenti sono stati miscelati, poiché l'aggiunta di RSH alla miscela contenente nucleotidi avvia il saggio di attività enzimatica.

Per controllare l'idrolisi dell'ATP dall'attività contaminante della nucleasi, assemblare una reazione da 10 microlitri che non contiene proteine e incubarla in parallelo. Individuare campioni da 2 microlitri a t = 0 e alla fine dell'esperimento per assicurarsi che l'ATP non sia stato idrolizzato in assenza di proteine.

Immediatamente dopo l'aggiunta di RSH, rimuovere 2 microlitri e posizionarlo sulla piastra di cellulosa PEI etichettata come campione t = 0 minuti.

Incubare la reazione a 37 gradi Celsius, rimuovendo aliquote da 2 microlitri nei punti temporali desiderati. Dopo aver raccolto tutte le aliquote, eseguire la cromatografia su strato sottile riempiendo la camera cromatografica con 1,5 molari di fosfato di potassio monobasico a una profondità di 0,5 centimetri. Immergere il bordo inferiore della piastra nel solvente e lasciare che il solvente migri verso la parte superiore della piastra per circa 90 minuti.

Rimuovere la piastra dalla vasca per cromatografia e posizionarla su uno stendibiancheria da banco per asciugarla all'aria durante la notte. Dopo che la lastra è asciutta, avvolgerla in una pellicola di plastica per evitare il trasferimento di materiale radioattivo alla cassetta di imaging e analizzare mediante autoradiografia.

Esporre la piastra di cellulosa PEI contenente reazioni separate a una cassetta phosphorimager per quattro ore a temperatura ambiente. Dopo l'esposizione, creare un'immagine della cassetta con una termocamera al fosforo.

Utilizzando un software di imaging con un'interfaccia utente grafica, disegna le regioni di interesse o il ROI, selezionando prima "Disegna rettangolo". Quindi, usa il mouse per disegnare ROI rettangolari attorno a un'intera corsia e ai punti di ATP e guanosina tetrafosfato contenuti all'interno di quella corsia.

Utilizzare i comandi "Seleziona, Copia e Incolla" per disegnare ROI identiche all'interno delle altre corsie, per assicurarsi che le ROI misurino i segnali all'interno di aree identiche in ciascuna corsia. Includi le ROI di una corsia inutilizzata da utilizzare come spazi vuoti.

Utilizzando il pulsante "Analizza | Strumenti | Responsabile del ROI | Aggiungi" del software di imaging, selezionare tutte le ROI disegnate sulla lastra di cellulosa PEI. Ora, usa il pulsante "Analizza | Imposta le misure | Misura" per quantificare l'intensità del segnale all'interno di ciascun ROI ed esportare le misurazioni come foglio di calcolo. Nel foglio di calcolo, sottrai i valori di ROI vuoti dai segnali sperimentali.