Saggio dell'attività enzimatica basato sulla cromatografia su strato sottile: una tecnica per determinare l'attività della pirofosfochinasi in vitro utilizzando la cromatografia su strato sottile
JoVE Enciclopedia degli esperimenti
Tecniche Biologiche
0 visualizzazioni • 6:04 min. • July 8th, 2025
La pirofosfochinasi catalizza il trasferimento del difosfato o del pirofosfato dal precursore nucleotidico, come l'adenosina trifosfato, ATP, al substrato come la guanosina difosfato, GDP. Questo forma la guanosina tetrafosfato, un'importante molecola di segnalazione.
Per determinare l'attività della pirofosfochinasi, preparare una miscela di reazione comprendente GDP e ATP radiomarcati in un tampone adatto integrato con cloruro di magnesio. Aggiungere la quantità desiderata di pirofosfochinasi alla miscela di reazione e incubare.
Nel corso del tempo, in presenza di ioni magnesio, la pirofosfochinasi inizia a trasferire la frazione pirofosfato radiomarcata dall'ATP al GDP, producendo guanosina tetrafosfato radioattiva.
Ora, prendete una cromatografia su strato sottile o TLC, piastra prerivestita con polietilenimmina-cellulosa, una fase stazionaria a base di polimeri cationici. Individuare le aliquote degli analiti della miscela di reazione vicino alla base della piastra TLC in diversi punti temporali per arrestare la reazione e valutare i progressi.
Immergere la piastra in una camera di vetro contenente fosfato di potassio monobasico, un solvente in fase mobile. Quando il fronte de
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