Elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato per l'analisi delle proteine: una tecnica per separare e visualizzare le proteine in base al peso molecolare

Iniziare trattando il campione di proteine con un tampone denaturante comprendente un detergente - dodecil solfato di sodio, SDS e un agente riducente - beta-mercaptoetanolo. Scaldalo brevemente. Durante questa fase, il beta-mercaptoetanolo interrompe i legami disolfuro, creando una conformazione dispiegata della proteina.

Le proteine dispiegate con i loro amminoacidi idrofobici esposti si legano alla SDS caricata negativamente e acquisiscono una carica negativa uniforme. Aggiungere un colorante di tracciamento adatto al campione per la visualizzazione in tempo reale.

A questo punto, caricare il campione e il marcatore di dimensioni molecolari standard in pozzetti separati presenti nel gel di impilamento, lo strato superiore del gel di poliacrilammide contenente una concentrazione inferiore di polimeri di acrilammide reticolati.

Collegare l'apparecchio in gel riempito di tampone all'alimentazione.

In presenza di un campo elettrico, le proteine caricate negativamente migrano liberamente verso l'anodo e si impilano insieme per entrare nel gel risolutivo, lo strato inferiore contenente un gel a concentrazione più elevata.

Nel gel risolutivo, le proteine iniziano a migrare in base alle loro dimensioni molecolari, con le proteine più piccole che migrano rapidamente, con conseguente risoluzione ottimale delle bande proteiche. Successivamente, interrompere la corsa e rimuovere il gel.

Colorare il gel con un colorante anionico, il blu Coomassie, che si lega elettrostaticamente agli amminoacidi basici delle proteine, conferendo loro una colorazione blu. Successivamente, stendere il gel in soluzione di acido acetico per una migliore visualizzazione.

Rimuovere il gel e identificare le proteine separate in base al loro peso molecolare stimato.

Preparare due gel separatori come descritto nel manoscritto del testo. Versare il gel tra le piastre di vetro utilizzando una pipetta da 1 millilitro, assicurandosi che i 2 centimetri superiori siano privi del composto. Aggiungere il 70% di etanolo sopra il gel separatore, creando un'interfaccia uniforme tra i due strati.

Una volta che i gel di separazione si sono polimerizzati, preparare i gel di impilamento seguendo le istruzioni nel manoscritto del testo. Quindi, rimuovere l'etanolo dai gel di separazione e aggiungere la soluzione di gel di impilamento. Inserire con cura un pettine con il numero di tasche desiderato, senza introdurre bolle d'aria, e lasciare polimerizzare il gel per 20-30 minuti.

Caricare 4 microlitri di ciascun campione, così come la scala delle proteine, in pozzetti separati. Quindi, far scorrere il gel nel tampone di corsa Tris-Glycine a 144 volt per 45 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare la soluzione Fairbanks preriscaldata A per colorare i gel su un bilanciere per 30 minuti e la soluzione Fairbanks preriscaldata D per decolorare i gel su un bilanciere fino a ottenere lo sfondo desiderato.