Elettroforesi su gel di agarosio semi-denaturante bidimensionale: una tecnica per separare le fibre di amiloide polimorfiche in base all'eterogeneità dimensionale

Le fibre amiloidi sono aggregati di proteine mal ripiegate, che mostrano eterogeneità dimensionale. Queste fibre, essendo resistenti ai detergenti anionici come l'SDS, possono essere analizzate utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio semi-denaturante bidimensionale.

Per iniziare, prendi un gel di agarosio preassemblato di grandi dimensioni che contenga SDS. L'elevata porosità permette la separazione delle fibre intatte durante la corsa. Sovrapporre il gel con un tampone di corsa contenente SDS.

Caricare nel gel un lisato cellulare contenente fibre amiloidi. La presenza di SDS e l'assenza di una fase di riscaldamento del campione crea condizioni semi-denaturanti in cui il detergente si lega ad amiloidi altamente resistenti impartendo una carica negativa uniforme alle fibre intatte.

Far funzionare il gel nella prima dimensione alla tensione appropriata. Il campo elettrico provoca la migrazione di amiloidi caricati negativamente verso l'anodo caricato positivamente.

Durante la corsa, le fibre più piccole migrano rapidamente rispetto a quelle più grandi, formando un modello a bande simile a una macchia che indica l'eterogeneità delle dimensioni.

Al termine, ruotare il gel perpendicolarmente ed eseguirlo nella seconda dimensione. In questa dimensione, le fibre si muovono in modo identico alla prima corsa separandosi in base alle loro dimensioni. Questo crea una macchia diagonale poiché le fibre più piccole migrano più velocemente di quelle più grandi.

La formazione della banda diagonale acuminata conferma una popolazione amiloide fibrillare intatta ma eterogenea.

Per preparare il gel, aggiungere 2 grammi di polvere di agarosio a 200 millilitri di tampone TAE in un becher di vetro. Quindi, scaldare il becher in un forno a microonde per sciogliere l'agarosio.

Successivamente, aggiungere 1 millilitro di SDS al 20% a una concentrazione finale dello 0,1%. Agitare delicatamente il bicchiere.

Successivamente, versare l'agarosio liquido su una lastra di gel di 15 cm x 14 cm. Per rimuovere eventuali bolle d'aria, utilizzare una pipetta da 1 millilitro. Quindi, posiziona un pettine da 20 pozzetti sopra il gel.

Quindi, aggiungi circa 60 microgrammi di lisato a cellule intere nella corsia all'estrema destra del gel. Far funzionare il gel a 60 volt per circa quattro ore, utilizzando il tampone TAE contenente lo 0,1% di SDS, come tampone di corsa.

Per far scorrere il gel nella seconda dimensione, ruotare con cautela il gel di 90 gradi in senso antiorario. Quindi, fai funzionare la prigione a 60 volt per circa quattro ore.