Un Matrigel-Based Formazione Assay tubo per valutare l'attività vascolare delle cellule tumorali
September 7th, 2011
Un test formazione del tubo viene usato per valutare l'attività vascolare delle cellule tumorali.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare la formazione di tubi di vari tipi di cellule tumorali in vitro come un modo per misurare l'attività vascolare in vivo. Ciò si ottiene aggiungendo cellule tumorali su matrigel per indurre la formazione di due. Come secondo passo.
Le cellule del gel matri vengono incubate durante la notte a 37 gradi Celsius, il che consente la formazione del tubo. Successivamente, vengono visualizzate le provette prodotte da ciascun tipo di cellula. Al fine di quantificare il numero medio di provette formate da ciascun tipo di cellula, si ottengono risultati che mostrano la potenziale capacità di queste cellule di formare vascolarizzazione in vivo sulla base di modelli tumorali xenotrapianto.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca sul cancro, ad esempio come misurare l'attività vascolare in vitro Per preparare le cellule tumorali iniziare coltivando UAD sette melanoma, B 16 F1 MDA, MB 4 35 o colon HCT uno 16 cellule. In DMEM integrato con il 10% di FPS e coltura di penicillina. Cellule endoteliali microvascolari umane o H ECS in terreno EBM two integrato con un microgrammo per millilitro di idrocortisone, un nanogrammo per millilitro, fattore di crescita epidermico 10% FBS e penicillina.
La streptomicina lava le cellule con PBS, quindi stacca con tripsina EDTA allo 0,05%, pellet le cellule a 2000 RRP M per cinque minuti. Quindi lavarli nuovamente con PBS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro per preparare il gel matra caldo.
Un millilitro di eloqua di fattore di crescita ha ridotto il matri gel a temperatura ambiente. Quindi metterlo immediatamente sul ghiaccio per 10 minuti. Pipettare 50 microlitri nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti.
E per incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti, risospendere una o due volte 10 alla quinta cellula tumorale o endoteliale rispettivamente in DMEM o e BM due e caricarle sulla parte superiore del matrigel. Se si studiano gli effetti dei reagenti sullo sviluppo dei tubuli, aggiungere il reagente al terreno libero dal siero incubare per una notte a 37 gradi Celsius. Per l'analisi delle immagini, aggiungere 10 microlitri di soluzione formale e salina al 10% per 10 minuti.
Quindi eseguire l'imaging utilizzando un microscopio a contrasto di fase con un obiettivo 10x. Conta il numero di tubuli in tre o cinque campi casuali da ciascuno. Bene, allora fai una media qui.
Gli HMC sono stati utilizzati come controllo positivo poiché questi tubuli si sono sviluppati da corpi cellulari allungati chiari che si sono collegati per formare una rete poligonale. Le cellule B 16, F1, U 87 e MDA MB 4 35 hanno sviluppato tubuli vascolari simili a quelli formati da Hecs. Ma HCT uno 16 cellule no.
La formazione di tubi dose-dipendenti è stata testata in cellule U 87. Come dimostrato in questa figura, 10.000 cellule hanno formato tubuli fuori produzione una volta che le cellule sono state raddoppiate. Una solida rete vascolare era paragonabile a quella osservata nell'Hecs.
Al contrario, nell'inaugurare con meno di 5.000 cellule non sono riuscite a formare un fenotipo vascolare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare con successo un esperimento di saggio in provetta matrigel per misurare la formazione di provette di cellule tumorali in vitro.
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Panoramica
Questo studio utilizza un saggio di formazione di tubi per valutare l'attività vascolare di vari tipi di cellule tumorali in vitro. Analizzando la formazione di tubi sul matrigel, i ricercatori possono dedurre il potenziale di queste cellule di sviluppare un'architettura vascolare in vivo.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Oncologia
Contesto
- L'attività vascolare è cruciale per la crescita e la metastasi del tumore.
- I saggi di formazione di tubi sono un metodo standard per valutare il potenziale angiogeno.
- Il matrigel fornisce un ambiente adatto per valutare il comportamento cellulare.
- Comprendere la vascolarizzazione delle cellule tumorali può informare le strategie terapeutiche.
Obiettivo dello studio
- Misurare la formazione di tubi di diversi tipi di cellule tumorali.
- Valutare l'attività vascolare di queste cellule in vitro.
- Fornire informazioni sul loro potenziale comportamento in vivo basato su modelli di xenotrapianto.
Metodi utilizzati
- Aggiungere cellule tumorali sul matrigel per indurre la formazione di tubi.
- Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius.
- Eseguire l'imaging dei tubi prodotti da ogni tipo di cellula.
- Quantificare il numero medio di tubi formati da ogni tipo di cellula.
Risultati principali
- I risultati indicano capacità diverse delle cellule tumorali di formare architettura vascolare.
- I dati quantitativi riflettono il potenziale di vascolarizzazione in vivo.
- Diversi tipi di cellule tumorali mostrano caratteristiche distinte di formazione di tubi.
- I risultati supportano l'uso di modelli di xenotrapianto per ulteriori ricerche.
Conclusioni
- Il saggio di formazione di tubi è efficace per valutare l'attività vascolare delle cellule tumorali.
- Comprendere questi meccanismi può aiutare nello sviluppo di terapie mirate.
- Sono necessari ulteriori studi per esplorare le implicazioni di questi risultati.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Assessing vasculogenic activity in tumor cells provides early insight into tumor-driven vascular network formation, a key mechanism in tumor progression independent of angiogenesis. This assay enables mechanistic de-risking by identifying tumor subtypes capable of vasculogenic mimicry, informing target validation and phenotypic screening strategies. It supports predictive confidence in preclinical models by linking in vitro tube formation to in vivo vascular channel formation observed in xenograft models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates tumor cell plasticity and vasculogenic potential to clarify therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Enables functional validation of tumor-specific vascular phenotypes independent of endothelial angiogenesis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying cell lines with vasculogenic mimicry capacity for downstream target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized tumor cell systems for assessing vascular phenotype formation in a reproducible extracellular matrix.
- Operational Value: Delivers quantitative, imaging-based readouts of tube formation to enable assay standardization and scalability.
- Screening Readiness: Supports screening of diverse cell types (e.g., melanoma, glioblastoma, breast cancer) for vascular potential based on cell dose-dependent responses.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling vasculogenic mimicry observed in patient-derived melanoma and glioblastoma tissues.
- Operational Value: Provides continuity from discovery to preclinical validation by correlating in vitro tube formation with in vivo vascular channel formation in xenograft models.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by distinguishing vasculogenic-capable (e.g., U87, MDA-MB-435) from non-capable (e.g., HCT116) tumor models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for oncology programs targeting tumor microenvironment and vascular phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of tumor cell vasculogenic potential and pathway clarification of mimicry mechanisms.
- Screening: Enables assay readiness through standardized Matrigel preparation, cell seeding, and incubation protocols yielding reproducible tubule formation.
- Analytics: Generates quantitative tubule counts from phase-contrast imaging to compare vascular activity across cell lines and conditions.
- Translational Research: Links in vitro vascular phenotype to in vivo relevance via xenograft models showing perfusable vascular channels in tumors.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for assessing vascular potential across tumor types and compound effects on tubule development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around tumor-driven vascularization.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined cell seeding densities, incubation times, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying tumor models with vasculogenic mimicry, reducing late-stage biological risk in angiogenesis-focused programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of tumor targets based on demonstrated vascular channel formation capacity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, Matrigel handling, and phase-contrast microscopy for accurate tubule visualization and quantification.
- Depends on access to growth factor-reduced Matrigel, incubators, and imaging systems capable of resolving tubular networks at 10x magnification.
- Necessitates standardization across teams for cell seeding density (e.g., 10,000–20,000 cells/well) and incubation duration to ensure comparable tube formation readouts.
- Requires adaptation when applying to different tumor models due to variable vasculogenic potential, as seen in differential responses of U87 versus HCT116 cells.
- Limited by the assay’s endpoint nature, which captures structural tube formation but not real-time dynamics or perfusion functionality without additional validation.
