Name: Imaging ex vivo di cellule T nel Fette murini Linfonodo con grandangolari e microscopi confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri l'imaging ex vivo di cellule T fluorescenti in fette di linfonodo murino con microscopia a campo largo e confocale. Questo metodo consente l'analisi in tempo reale della migrazione cellulare nel tessuto linfatico.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Alain Trautmann, che ci ha incoraggiato a compiere fette linfonodi. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti della Ligue Nationale Contre le Cancer, la Fondation pour la Recherche Médicale en France e l&#39;Association pour la recherche sur le Cancer.

1. Preparare le fette di linfonodi <ol><li> Preparare un 4% a basso punto di fusione soluzione di agarosio per l'incorporamento. Diluire agarosio in PBS e forno a microonde questa soluzione. Quando l'agarosio è completamente sciolto, mantenere la soluzione a 37 ° C fino al momento dell'utilizzo. </li><li> Preparare un 6-e piastra di coltura dei tessuti. Aggiungere 1,1 ml terreno di coltura RPMI completo per bene, e inserire un filtro organotipica in ciascun pozzetto. Posizionare il 6 pozzetti a 4 ° C fino al momento di trasferire fette. </li><li> Luogo rondelle in acciaio inossidabile, con diametro interno di 4 mm, in un piatto di plastica riempita con mezzo di RPMI completo. Rondelle saranno ulteriormente utilizzati per concentrare le cellule sulla fetta tagliata vibratome. </li><li> Sacrificare il mouse in conformità alla normativa vigente sul benessere degli animali. Rimuovere con cura i linfonodi periferici dal tessuto circostante e metterli in un piatto di plastica contenente ghiacciata PBS. Bisogna fare attenzione a non danneggiare la struttura dei linfonodi, in quanto questi organi sono molto morbide. </li><li> Versare il 4%-gel in una da 35 mm piatto di plastica e delicatamente trasferire i nodi nel gel. Lasciare il gel in ghiaccio per 5 minuti a indurire. </li><li> Rimuovere il blocco dal piatto e tagliare l'agar in modo da lasciare 3-5 mm di gel intorno ad ogni linfonodo. </li><li> Collegare i nodi incorporato nel disco campione del vibratome con colla non tossica dei tessuti. Installare il disco campione nel vassoio pieno di ghiaccio PBS freddo. </li><li> Sezione l'agar-embedded tessuto a 320 micron di spessore con la velocità vibratome impostato su una gamma lenta (0,3 mm / s) e la frequenza di vibrazione impostata su un medio raggio (1,5 mm). </li><li> Cura il trasferimento fette linfonodi mentre vengono tagliati sul inserti cultura organotipica utilizzando una pinza sottile. Posto 3 fette su ogni inserto. Fare molta attenzione come fette può essere facilmente danneggiato. Un nodo tipico linfonodi periferici produrrà 5 sezioni al taglio a 320 micron. Eliminare le fette prima e l'ultima, in quanto contengono solo i tessuti superficiali. </li><li> Luogo rondelle in acciaio inossidabile su ogni fetta individuali. Assicurarsi che le rondelle sono ben posizionate sul agarosio che circonda il tessuto. </li><li> Incubare la piastra di coltura a 37 ° C in un 5% di CO 2 incubatore umidificato fino al momento di piatto cellule T. </li></ol> 2. Isolare le cellule T da linfonodi del mouse <ol><li> Isolare le cellule T ai sensi dell'articolo precedentemente pubblicato JOVE 3. </li><li> Utilizzare le cellule T e passare immediatamente alla sezione successiva. In caso contrario, i linfociti possono essere colti durante la notte in completo RPMI-medium supplementato con 10 ng / ml di IL-7. </li></ol> 3. L'etichettatura di isolate cellule T <ol><li> Lavare le cellule in HBSS. Risospendere loro nel buffer stesso a 10 x 10 6 per ml. </li><li> Aggiungere lo stesso volume di HBSS contenente 1 mM cellulare Tracker verde CMFDA dando una concentrazione finale di 0,5 micron. </li><li> Incubare la sospensione cellulare a 37 ° C per 5 min. Lavare le cellule due volte con RPMI completo e medie. </li><li> Risospendere le cellule ad una concentrazione finale di 10 x 10 6 per ml in completo RPMI-media. Queste cellule etichettate saranno placcato sulla fette. </li></ol> Altri coloranti fluorescenti che CMFDA potrebbe essere usato anche, ma di tenere presente che queste molecole sono potenzialmente tossici sopra determinate concentrazioni. 4. Placcatura cellule etichettati T su fette di linfonodi <ol><li> Rimuovere l'eccesso di medie contenute nella parte interna della lavatrice con una pipetta. Non lasciare che il tessuto di diventare secco; lavorare velocemente durante questa fase. </li><li> Delicatamente dispensare 10-20 cellule T microlitri etichettati che corrisponde a 1 a 2 x 10 5 cellule della parte interna della lavatrice. Bisogna fare attenzione a non toccare il tessuto con la punta della pipetta. Assicurarsi che la goccia di sospensione cellulare rimane al suo posto. </li><li> Mettere le fette con le cellule in incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2 per almeno 30 minuti per consentire la migrazione dei linfociti nel tessuto. </li></ol> 5. Imaging cellule T all'interno fette linfonodi In questo video-articolo, le cellule T immagine fluorescente a fette linfonodale con un microscopio invertito widefield e un microscopio confocale in posizione verticale. <ol><li> Impostare la temperatura a 37 ° C. I nostri microscopi sono dotati di camere a temperatura controllata. </li><li> Installare un sistema di perfusione che permette perfusione continua della fetta linfonodale con ossigenato (5% CO 2, 95% O 2) rosso fenolo senza medium RPMI. Nel nostro sistema, perfusi dei media entra nella camera di immagini da una parte per gravità. Il mezzo viene aspirato con una pompa collegata ad un pallone di raccolta dei rifiuti. Impostare la portata media di 1 ml / min. </li><li> Con una pinza sottile, togliere delicatamente la fetta da 6 pozzetti e immergere la preparazione in riscaldato medio ossigenato RPMI per qualche secondo per liberarsi di cellule fluorescenti non infiltrato nel tessuto. </li></ol> ImaGing cellule T con un ampio campo di microscopio invertito <ol start="4"><li> Mettere la fetta a testa in giù su una misura da camera di imaging che consiste in fili di nylon incollato sulla parte interna di un piatto fondo di vetro. In questa camera, i fili di nylon elevare la fetta dal vetro e consentire la soluzione ossigenata di diffondere nel tessuto. Ciò è necessario come la migrazione delle cellule T nei linfonodi è fortemente dipendente da ossigeno. Fissare la fetta su di esso con l'aggiunta di una rondella in acciaio inox. In queste condizioni, la fetta si trova pochi micron sopra il fondo del piatto, che facilita il rinnovo della soluzione di perfusione. </li><li> Per catturare un grande campo di vista (800 x 800 micron, circa un terzo della superficie fetta del nodo), raccogliere le immagini utilizzando una lente a 10x obiettivo a secco. Abbiamo scoperto che il 10x Nikon S fluoro 0,5 NA era più adatto per le nostre analisi. </li></ol> Un tipico time-lapse esperimento di imaging ottico cattura 5 piani che coprono una profondità totale di 50 micron in (z) dimensione assiale. Fluorescenti le cellule T sono di solito ripreso ad intervalli che vanno 10 a 30 secondi per 10 a 20 min. Imaging cellule T con un microscopio confocale in posizione verticale Il microscopio confocale utilizzato in questo protocollo è un SP5 Leica dotato di un obiettivo 20x immersione in acqua (Olympus, 20x/0.95 NA). <ol start="6"><li> Fissare la sezione per la fase di imaging del microscopio. Nota: solitamente una rondella sulla preparazione per immobilizzarla. </li><li> Impostare una sessione di imaging, raccogliendo una serie di immagini lungo l'asse z.. Alle cellule T immagine in una struttura di tessuto intatto, la posizione di partenza è di solito impostato a 5 a 10 micron di sotto della prima cellula T etichettati. </li></ol> 6. Rappresentante risultati Seguendo questo video-protocollo si dovrebbe aspettare di visualizzare un gran numero di cellule T fluorescenti accumulate nella zona T del nodo, un fenomeno che si verifica normalmente in questo particolare ambiente in vivo (Figura 1). In particolare, le cellule T dovrebbe essere esclusa dalle zone delle cellule B, che di solito sono appena sotto la capsula. Un esperimento riuscito anche portare a cellule T reclutati nel tessuto (Figura 2), mostrando un comportamento altamente mobili (Figura 3) in linea con i risultati pubblicati ottenuti nei linfonodi intatti 4. In media, la velocità media delle singole cellule T in fette devono essere vicini ai 10 micron / min (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Le cellule T si accumulano in una fetta linfonodo. Fluorescenza marcata con cellule T (CMFDA, verde) sono stati aggiunti a un linfonodo fetta 30 minuti prima acquisizione delle immagini (foto in alto). L'immagine è la proiezione massimo di 5 immagini coprono 50 micron in direzione z. L'immagine in campo chiaro è mostrato in basso. Le immagini sono state catturate con un microscopio widefield. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Le cellule T sono reclutati in una fetta linfonodo. Fluorescenza marcata con cellule T (CMFDA, verde) sono stati aggiunti a un linfonodo fetta 30 minuti prima di acquisizione delle immagini utilizzando un microscopio confocale. Le immagini sono state catturate in superficie tagliata (foto in alto) e 40 micron al di sotto (foto in basso). <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Le cellule T sono estremamente mobili all'interno di una fetta linfonodo. Fluorescenza marcata con le cellule T sono state ripreso durante 12 minuti utilizzando un microscopio widefield. Traiettorie di singole cellule T vengono visualizzati come colori tracce di rappresentare spostamenti crescente dal blu (bassa cellule mobili) a (cellule di alta mobili) rosso. Tracce sono state calcolate utilizzando il software Imaris. La linea bianca segue il bordo del nodo, mentre l'ovale tratteggiato delimita la zona delle cellule B putativo. <img src="/files/ftp_upload/3054/3054fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. All'interno di una fetta dei linfonodi, la velocità delle cellule T è vicino ai 10 micron / min. Le velocità sono state calcolate utilizzando il software Imaris dalle tracce rappresentato in figura 3.

<ol><li>Asperti-Boursin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+ligands+control+basal+T+cell+motility+within+lymph+node+slices+in+a+phosphoinositide+3-kinase-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner.</a> J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).</li>
<li>Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+oscillations+regulate+thymocyte+motility+during+positive+selection+in+the+three-dimensional+thymic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment.</a> Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).</li>
<li>Matheu, M. P., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+CD4%2B+T+cells+from+mouse+lymph+nodes+using+Miltenyi+MACS+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1869 (2002).</li>
<li>Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+chemotaxis+and+substrate+restriction+to+segregation+of+immature+and+mature+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes.</a> Immunity. 31, 986-986 (2009).</li>
<li>Gollmer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCL21+mediates+CD4%2B+T-cell+costimulation+via+a+DOCK2%2FRac-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway.</a> Blood. 114, 580-580 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo descritto una semplice, tecnica veloce e robusto per la produzione di fette di linfonodi, che sono utilizzati per studiare il comportamento delle cellule T introdotto. Negli ultimi anni, questo metodo è stato applicato con successo con timo e linfonodi fette di identificare i fattori extracellulari il controllo del posizionamento e della motilità delle cellule T 1,5. E &#39;stato anche utilizzato per misurare Ca 2 + risposte in timociti durante la selezione positiva e nelle cellule T sul riconoscimento dell&#39;antigene 2,6. Il test fetta sovrapposizione presenta vantaggi e limitazioni che meritano di essere discussi. Di nota, questo sistema consente l&#39;accesso al tessuto, utile se si ha la necessità di manipolare fette farmacologicamente in modo da interferire con il controllo molecolare della migrazione cellulare. A seguito di imaging, le fette possono essere trattati per immunoistochimica per raccogliere ulteriori informazioni sulle strutture che sono state fotografato. Inoltre, l&#39;osservazione può essere fatta con un tradizionale microscopio a fluorescenza widefield. Anche se la risoluzione non è buono come con un confocale o un microscopio a due fotoni e che fototossicità in linea di principio più grave con un solo fotone che con la microscopia a due fotoni, ha i vantaggi di semplicità, un costo inferiore, e più grande scelta di lunghezze d&#39;onda di eccitazione. L&#39;imaging di cellule T in un linfonodo intatto richiede l&#39;iniezione endovenosa di linfociti etichettati che successivamente a casa per gli organi linfoidi. Come abbiamo mostrato in precedenza 1, il test fetta è perfettamente compatibile con l&#39;esperimento di trasferimento adottivo. Tuttavia, il tempo necessario per le cellule T a casa nei linfonodi può complicare l&#39;uso di coloranti fluorescenti che hanno la tendenza a fuoriuscire delle cellule nel corso del tempo. Questo è il caso del Ca 2 + colorante Fura-2. Con il reclutamento veloce (&lt;30 min) di cellule T nel tessuto, il saggio fetta offre l&#39;opportunità di utilizzare tali coloranti. Infine, questo metodo ha il grande vantaggio di analizzare le funzioni delle cellule T in diversi tessuti umani tenuti in vita. Questo sistema sperimentale presenta anche dei limiti che devono essere tenuti in mente. Danni associati con le operazioni di affettamento può influire sul funzionamento delle cellule T, specialmente nella regione superficiale del tessuto vicino alla superficie di taglio. Al fine di valutare la morte delle cellule all&#39;interno della fetta, abbiamo usato il colorante fluorescente verde SYTOX che penetra le cellule con membrana plasmatica compromessa. I nostri esperimenti rivelano che circa il 20% del totale delle cellule nodali, per lo più localizzate nella regione superficiale del tessuto, sono state marcate con il colorante nucleare. Un altro problema potenziale con il test è la capacità delle fette di conservare importanti fattori solubili tra cui chemochine. Anche se abbiamo alcuna indicazione che i nostri dati sono stati colpiti da problemi di questo tipo dato che le cellule T visualizzare una buona mobilità all&#39;interno della fetta, vorremmo sottolineare l&#39;importanza di imaging cellule T nelle regioni sano situato a qualche decina di micron dalla superficie tagliata. Considerando che questo potrebbe essere fatto con microscopi tradizionali (widefield o confocale), come in questo protocollo, è probabile che il nodo preparazione linfa fetta combinato con due fotoni di imaging aumenta la risoluzione spaziale in profondità e ridurre la fototossicità.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Leica </td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1200S </td><td></td></tr><tr><td> Pinza multa </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 14142 </td><td></td></tr><tr><td> 30 inserti Cultura millimetri </td><td> Millipore </td><td> PICM0RG50 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 61870010 </td><td> Completo RPMI-media è fatta aggiungendo il 10% di siero di siero fetale bovino e penicillina / streptomicina </td></tr><tr><td> Sale Hanks &#39;soluzione equilibrata (HBSS) </td><td> Invitrogen </td><td> 14170088 </td><td></td></tr><tr><td> Bassa temperatura di gelificazione agarosio, tipo VII-A </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701 </td><td></td></tr><tr><td> Butile Colla cianoacrilato, Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469 </td><td></td></tr><tr><td> Rondelle in acciaio inossidabile, 4 mm di diametro interno </td><td> Bricolage </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cellula Tracker verde CMFDA </td><td> Invitrogen </td><td> C7025 </td><td></td></tr></tbody></table>

imaging ex vivo di cellule t nel fette murini linfonodo con grandangolari e microscopi confocale

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Naïve cellule T in continuo traffico di organi linfatici secondari, compresi i linfonodi periferici, per individuare rari antigeni espressi. La migrazione delle cellule T nei linfonodi è un processo complesso che coinvolge sia fattori chimici tra cui cellulari e chemochine. Recentemente, l&#39;uso di microscopia a due fotoni ha permesso di tracciare le cellule T nei linfonodi intatti e per ricavare alcune informazioni quantitative sul loro comportamento e le loro interazioni con altre cellule. Mentre ci sono evidenti vantaggi di un sistema in vivo, questo approccio richiede una strumentazione complessa e costosa e fornisce un accesso limitato al tessuto. Per analizzare il comportamento delle cellule T all&#39;interno di linfonodi murini, abbiamo sviluppato un saggio fetta 1, originariamente istituito da neurobiologi e recepita di recente per murini timo 2. In questa tecnica, fluorescente cellule T sono placcati in cima ad una fetta linfa acutamente preparato nodo. In questo video-articolo, la localizzazione e la migrazione delle cellule T nel tessuto vengono analizzati in tempo reale con un widefield e un microscopio confocale. La tecnica che integra in vivo microscopia a due fotoni offre un approccio efficace per l&#39;immagine delle cellule T nel loro ambiente naturale e per chiarire i meccanismi alla base della migrazione delle cellule T.

Questo protocollo descrive un metodo per le cellule T immagine fluorescente introdotto a fette linfonodo. La tecnica permette in tempo reale analisi della migrazione delle cellule T con widefield tradizionali microscopi a fluorescenza o confocale.

Imaging ex vivo di cellule T nel Fette murini Linfonodo con grandangolari e microscopi confocale

Le cellule T naïve migrano continuamente verso gli organi linfoidi secondari, inclusi i linfonodi periferici, per rilevare antigeni espressi raramente. La migrazione...

L'obiettivo generale di questa procedura è acquisire immagini di linfociti T fluorescenti in sezioni di linfonodo mediante microscopia a campo largo e microscopia confocale. Questo viene realizzato innanzitutto rimuovendo un linfonodo di topo ed incorporandolo in agar a basso punto di fusione. Il linfonodo viene quindi tagliato in sezioni spesse 320 micron mediante un vibratomo.Successivamente, i linfociti T marcati con colorante fluorescente vengono seminati sulla superficie di una sezione di linfonodo. Infine, i linfociti T che hanno infiltrato la sezione vengono visualizzati mediante microscopia a campo ampio e microscopia confocale. In definitiva, è possibile ottenere immagini fisse e video che mostrano come i linfociti T vengano reclutati nel linfonodo e quale tipo di comportamento migratorio manifestino all'interno del tessuto linfatico. Okay.Il principale vantaggio di queste tecniche di un metallo esistente, come la fotomicroscopia e gli organi integri, è che qui le cellule T possono essere visualizzate in un sistema tridimensionale mediante un microscopio convenzionale a campo chiaro. Inoltre, grazie alle semplici preparazioni, è possibile accedere al tessuto. Iniziare preparando una soluzione al 4% di agarosio a basso punto di fusione. Ottenere la soluzione di agarosio diluendo l'agarosio in PBS e sottoponendo la miscela risultante a irraggiamento nel microonde, dopo che l'agarosio si è completamente disciolto.Mantenere la soluzione a 37 gradi Celsius fino all'uso. Successivamente, riempire una piastra di plastica con RPMI. Aggiungere il mezzo di coltura completo e posizionare rondelle di acciaio inossidabile con diametro interno di quattro millimetri nella piastra.Riempire un'altra piastra con PBS ghiacciato, quindi aggiungere circa 1,1 millilitro di RPMI. Aggiungere il mezzo di coltura completo per ogni pozzetto in una piastra per colture cellulari a sei pozzetti. Inserire un filtro organotipico in ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti e posizionare la piastra a quattro gradi Celsius.Rimuovere con attenzione i linfonodi periferici dai tessuti circostanti in un topo eutanasizzato. Dissezionare i linfonodi con cura poiché sono molto fragili. È molto importante rimuovere tutto il tessuto adiposo dal campione perché è altamente tossico per le cellule.Posizionare i linfonodi nella piastra di plastica contenente il PBS con ghiaccio secco. Versare quindi il gel al 4% di aro in una piastra di plastica da 35 millimetri e trasferire delicatamente i linfonodi nel gel. Successivamente, lasciare l'aro sul ghiaccio per cinque minuti affinché si indurisca; una volta indurito l'aro, rimuovere il blocco dalla piastra e tagliare l'agar, lasciando circa tre-cinque millimetri di gel intorno a ciascun linfonodo.Quindi utilizzare una colla atossica per fissare i nodi inclusi sul disco del campione di un viome. Installare il disco del campione nel vassoio rimovibile del viome e riempire il vassoio con PBS ghiacciato. Impostare la velocità del viome su un intervallo lento e la frequenza di vibrazione su un intervallo medio, sezionando il tessuto incluso in agar a uno spessore di 320 micron.Scartare la prima fetta poiché contiene solo tessuto superficiale, quindi utilizzare pinzette fini per trasferire con attenzione le fette di linfonodo man mano che vengono tagliate negli inserti per colture organotipiche. Posizionare rondelle di acciaio inossidabile su ciascuna fetta singola, assicurandosi che le rondelle siano posizionate attorno, e non sopra, il tessuto del linfonodo. Successivamente, incubare la piastra di coltura con le fette di linfonodo a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5%.Durante la preparazione dei linfociti T per questo passaggio, utilizzare colture di linfociti T trattati durante la notte con IL-7, isolati mediante selezione con microsferette positive per CD4 usando la purificazione con sistema Miltenyi MACS, come illustrato nell'articolo pubblicato in precedenza su JoVE da Matthew e Callaghan. Lavare i linfociti T in HBSS per cinque minuti a 300 × g a 20 °C. Ri-sospendere le cellule in HBSS fresco a una concentrazione di 10 × 10⁶ cellule per millilitro.Quindi aggiungere un micromolare di cell tracker green C-M-F-D-A in un tubo di HBSS e combinare questa soluzione con la sospensione cellulare per ottenere una concentrazione finale del colorante di 0,5 micromolare. Incubare la sospensione cellulare per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver lavato le cellule due volte con mezzo RPMI completo per cinque minuti a 300 × g e 20 gradi Celsius, risospendere le cellule T marcate a una concentrazione finale di 10 × 106 cellule per millilitro.In RPMI fresco, mezzo di coltura completo, recuperare le fette di linfonodo dall'incubatore. Rimuovere con una pipetta l'eccesso di mezzo contenuto al centro del portatessuti senza toccare il tessuto. Con la punta della pipetta, dispensare delicatamente dal 10 al 20 microlitri di linfociti T marcati al centro del portatessuti.Assicurarsi che la goccia di sospensione cellulare rimanga al suo posto. Incubare le sezioni e le cellule T per almeno 30 minuti per consentire ai linfociti di migrare nel tessuto. Per iniziare l'acquisizione delle immagini, impostare la camera di controllo della temperatura del microscopio a 37 gradi Celsius.Riempire un sistema di fusione per consentire la perfusione continua della sezione del linfonodo con mezzo RPMI privo di fenolo rosso e ossigenato, e contemporaneamente riscaldare una piccola capsula di plastica con RPMI ossigenato. Nel sistema qui mostrato, il mezzo perfuso entra nella camera di imaging da un lato per gravità. Il mezzo viene aspirato mediante una pompa collegata a un contenitore per i rifiuti.Con pinzette fini, estrarre dal incubatore le fette di linfonodo infiltrate da linfociti T. Rimuovere delicatamente una fetta di linfonodo dalla piastra a sei pozzetti. Immergere la fetta nel mezzo RPMI preriscaldato e ossigenato per alcuni secondi, in modo da eliminare le cellule fluorescenti che non sono penetrate nel tessuto.Quindi posizionare la sezione appena lavata capovolta sulla camera di imaging. I filamenti di nylon sollevano la sezione dal vetro e permettono alla soluzione ossigenata di diffondere nel tessuto. Questo è necessario poiché la migrazione dei linfociti T nei linfonodi dipende fortemente dall'ossigeno.Quindi fissare la sezione posizionando sopra un distanziale in acciaio inossidabile per acquisire un ampio campo visivo. Acquisire le immagini utilizzando un obiettivo secco con ingrandimento 10 volte. Trasferire la sezione del linfonodo appena lavata, con la faccia superiore rivolta verso l'alto, in una capsula di plastica.Posizionare una rondella sulla preparazione per immobilizzarla. Le sezioni sono ora pronte per essere analizzate mediante imaging. Montare la preparazione sul portacampioni del microscopio confocale eretto e mettere a fuoco utilizzando l'obiettivo 20 volte.Quindi avviare una sessione di acquisizione immagini e iniziare l'acquisizione. C-M-F-D-A. I linfociti T marcati in verde sono stati aggiunti a una sezione di linfonodo 30 minuti prima dell'acquisizione delle immagini, come mostrato qui. L'immagine è la proiezione massima di cinque immagini che coprono 50 micron nella direzione Z, acquisite con un microscopio a campo luminoso.La stessa figura può essere osservata come immagine in campo chiaro in questo video. Cellule T verdi fluorescenti che hanno infiltrato una sezione di linfonodo sono state immaginate con un microscopio a campo luminoso per nove minuti. L'animazione rappresenta una proiezione Z di 50 micron.Osservare la migrazione attiva dei linfociti T all'interno della sezione. Le traiettorie dei singoli linfociti T provenienti dallo stesso campo microscopico sono mostrate qui come tracce codificate a colori per rappresentare il crescente spostamento, dai linfociti poco mobili in blu ai linfociti altamente mobili in rosso. Le tracce sono state calcolate utilizzando un Mars.La linea bianca indica il margine del linfonodo, mentre le ellissi tratteggiate delimitano le presunte zone delle cellule B. In questo caso, le cellule T aggiunte a una sezione di linfonodo sono state riprese con un microscopio confocale per 10 minuti. L'animazione rappresenta una proiezione Z di 50 micron.Sì, questa tecnica può essere adattata ad altri tipi di tessuto. E ciò che è interessante è che la sezione rappresenta l'unico modo per esplorare i meccanismi alla base della migrazione e localizzazione delle cellule T nei tumori umani. Ad esempio.

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I meccanismi che regolano la motilità interstiziale di cellule CD4 T effettrici in siti di infiammazione sono relativamente sconosciuti. Presentiamo un approccio non invasivo per visualizzare e manipolare cellule CD4 T vitro -primed nel derma dell'orecchio infiammate, permettendo studio del comportamento dinamico di queste cellule in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

Descriviamo qui un modello di topo reporter transgenico per visualizzare le cellule produttrici di IL-22 all'interno di diversi tessuti di topo. Questo metodo può essere utilizzato per tracciare la posizione di altre citochine o proteine secretarie nel topo.

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Questo protocollo descrive un metodo per immagine residente tumore-infiltrazione CD8 T cellule identificate con gli anticorpi fluorescente accoppiati all'interno di fette di tumore del polmone umano. Questa tecnica permette in tempo reale analisi di migrazione delle cellule T CD8 usando la microscopia confocal.

Ex Vivo Imaging dei linfociti T CD8 residente nel tumore del polmone umano mediante microscopia confocale a fette

L'obiettivo del protocollo è di mostrare longitudinale videomicroscopia tracking in tempo reale dei timociti di scansione microscopia in impianti timici nell'alloggiamento anteriore dell'occhio del mouse laser. La trasparenza della cornea e la vascolarizzazione dell'innesto permette di registrare continuamente reclutamento di cellule progenitrici e l'uscita di cellula T maturo.

Inseguimento In Vivo dei timociti nell'alloggiamento anteriore dell'occhio di microscopia a scansione Laser in tempo reale

Questo protocollo descrive una tecnica per l'immagine di diverse popolazioni cellulari nel drenaggio dei linfonodi senza alterazioni nella struttura dell'organo.

Visualizzazione della struttura dei linfonodi e della localizzazione cellulare mediante la microscopia confocale Ex-Vivo

Descriviamo un metodo per visualizzare gli IEL con etichettatura GFP utilizzando l'imaging intravitale dell'intestino piccolo murino mediante microscopia confocale del disco rotante invertita. Questa tecnica consente il monitoraggio delle cellule vive all'interno della mucosa fino a 4 h e può essere utilizzata per studiare una varietà di interazioni immuno-epiteliali intestinali.

Imaging intravitale dei linfociti intraettali a Murine Small Intestine

La combinazione di etichettatura anticorpale, compensazione ottica e microscopia luminosa avanzata consente l'analisi tridimensionale di strutture o organi completi. Descritto qui è un metodo semplice per combinare l'etichettatura di fette renali spesse, la compensazione ottica con il cinnamate etilico e l'imaging confocale che consente la visualizzazione e la quantificazione delle strutture renali tridimensionali.

Cancellazione ottica e imaging del tessuto renale immunoetichettato

Scopri l'imaging ex vivo di cellule T fluorescenti in fette di linfonodo murino con microscopia a campo largo e confocale. Questo metodo consente l'analisi in tempo reale della migrazione cellulare nel tessuto linfatico.

Imaging ex vivo di cellule T nel Fette murini Linfonodo con grandangolari e microscopi confocale

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