Microscopia a immunofluorescenza per l'analisi delle rotture del DNA a doppio filamento

Per visualizzare specifiche proteine di risposta al danno al DNA nei siti di rottura del doppio filamento del DNA, DSB, utilizzando la microscopia a immunofluorescenza, iniziare con vetrini da microscopio contenenti monostrati di cellule mononucleate umane con DSB. Fissare le cellule con paraformaldeide.

Trattare con un detergente non ionico, membrane permeabilizzanti per l'accesso ai bersagli intracellulari. Aggiungere una soluzione bloccante contenente proteine, bloccando i siti di legame non specifici delle cellule. Incubare con anticorpi primari che si legano alle proteine di risposta bersaglio.

Trattare con una miscela di anticorpi secondari marcati con diversi fluorofori per legarsi in modo specifico ai rispettivi anticorpi primari attaccati alle proteine. Colora il DNA con DAPI. Aggiungere il supporto di montaggio; Montare il vetrino coprioggetti.

Durante la microscopia a fluorescenza, il raggio di luce incidente raggiunge il filtro di eccitazione consentendo il passaggio di una luce di una specifica lunghezza d'onda di eccitazione. Una volta raggiunto lo specchio dicroico, un divisore di fascio, la luce di eccitazione si riflette selettivamente verso la lente dell'obiettivo, che focalizza la luce sul campione.

La luce di eccitazione incidente eccita gli elettroni del fluoroforo ad uno stato energetico più elevato. Tornando allo stato fondamentale, gli elettroni emettono luce a una lunghezza d'onda maggiore, raccolta dalla lente dell'obiettivo e ripassata allo specchio dicroico.

Lo specchio consente alla luce a fluorescenza emessa di passare attraverso il filtro di emissione, che consente solo alla luce a fluorescenza desiderata di raggiungere il rivelatore. Elabora le immagini. Analizzare i diversi focolai fluorescenti colorati per visualizzare la co-localizzazione delle proteine di risposta al danno al DNA nel sito DSB.

Preparare due cytospin con cellule mononucleate dei campioni del paziente mediante centrifugazione di 1 x 10⁵ cellule per ogni preparazione. Fissare le celle con 200 microlitri di PFA al 4% per 10 minuti.

Dopo la fissazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 millilitri di PBS per cinque minuti ciascuna su uno shaker. Quindi, permeabilizzare le cellule con 200 microlitri di Octoxinol-9 allo 0,1% per 10 minuti. Lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 millilitri di soluzione bloccante al 5% per cinque minuti ciascuna su un agitatore da laboratorio. Bloccare le cellule in 30 millilitri di soluzione bloccante fresca al 5% per un'ora.

La fissazione e la permeabilizzazione delle cellule con paraformaldeide al 4% e Octoxinol-9 allo 0,1% ha preservato distintamente i focolai gamma H2AX e 53BP1.

Incubare una preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale di topo anti-gamma H2AX e l'altra preparazione delle cellule con un anticorpo monoclonale di topo anti-gamma H2AX e un anticorpo policlonale di coniglio anti-53BP1 durante la notte a 4 gradi Celsius.

Si raccomanda vivamente l'uso di comprovati anticorpi anti-gamma H2AX e anti-53BP1.

Dopo l'incubazione, lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 millilitri di soluzione bloccante al 2% per ogni cinque minuti su un agitatore da laboratorio.

Successivamente, incubare la prima preparazione delle cellule con un anticorpo secondario anti-topo di capra coniugato con Alexa488 diluito 1 su 500 in soluzione bloccante al 2%. Incubare la seconda preparazione delle cellule con un anticorpo secondario anti-topo di capra coniugato con Alexa488 e un anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con Alexa555 diluito 1 su 500 in soluzione bloccante al 2%.

Lavare delicatamente le cellule tre volte con 30 millilitri di PBS su un agitatore da laboratorio. Rimuovere il PBS e montare le celle con il mezzo di montaggio. Con cautela, mettere un vetrino coprioggetti sopra il supporto di montaggio, in modo che non siano incorporate bolle d'aria. Attendere almeno tre ore affinché il mezzo di montaggio si indurisca prima di analizzare le cellule mediante microscopia a fluorescenza.

Infine, analizzare i focolai gamma H2AX e 53BP1 nei nuclei cellulari con un microscopio a fluorescenza dotato di filtri per DAPI, Alexa488 e Cy3 durante l'imaging con un ingrandimento dell'obiettivo di 100x.