Microscopia a immunofluorescenza per l'analisi delle rotture del DNA a doppio filamento

Per visualizzare specifiche proteine di risposta al danno al DNA nei siti di rottura del doppio filamento del DNA, DSB, utilizzando la microscopia a immunofluorescenza, iniziare con vetrini da microscopio contenenti monostrati di cellule mononucleate umane con DSB. Fissare le cellule con paraformaldeide.

Trattare con un detergente non ionico, membrane permeabilizzanti per l'accesso ai bersagli intracellulari. Aggiungere una soluzione bloccante contenente proteine, bloccando i siti di legame non specifici delle cellule. Incubare con anticorpi primari che si legano alle proteine di risposta bersaglio.

Trattare con una miscela di anticorpi secondari marcati con diversi fluorofori per legarsi in modo specifico ai rispettivi anticorpi primari attaccati alle proteine. Colora il DNA con DAPI. Aggiungere il supporto di montaggio; Montare il vetrino coprioggetti.

Durante la microscopia a fluorescenza, il raggio di luce incidente raggiunge il filtro di eccitazione consentendo il passaggio di una luce di una specifica lunghezza d'onda di eccitazione. Una volta raggiunto lo specchio dicroico, un divisore di fascio, la luce di eccitazione si riflette selettivamente verso la lente dell'obiettivo