JoVE Encyclopedia of Experiments
Immunologia
0 visualizzazioni • 3:52 min • July 8th, 2025
Prendi il maschio anestetizzato wild-type e mutante Dicer-2 Drosophila su una piastra per iniezione sotto uno stereomicroscopio. Assicurati che le mosche siano prive di batteri simbiotici che sopprimono la replicazione del virus a RNA.
Inoculare i moscerini per via intra-toracica con un nano-iniettore contenente una sospensione virale di RNA a singolo filamento a senso positivo.
Il virus entra nella cellula ospite attraverso l'endocitosi mediata dal recettore e si replica producendo RNA intermedio a doppio filamento. Il recettore di riconoscimento del modello ospite Dicer-2 elabora l'RNA virale a doppio filamento in piccoli RNA interferenti, siRNA.
Il siRNA si lega al complesso di silenziamento indotto dall'RNA, RISC, dove viene rimosso il suo filamento complementare. I siRNA caricati con RISC si legano ad altri RNA virali tramite appaiamento di basi complementari, causando la degradazione dell'RNA virale e il silenziamento genico.
L'interazione tra Dicer-2 e RNA virale attiva le cascate di segnalazione antivirale a valle, producendo proteine antivirali. Queste proteine antivirali interagiscono con la Janus chinasi delle cellule ospiti vicine, o JAK, recettori delle citochine legate alle proteine, avviando la dimerizzazione del recettore e la fosforilazione di JAK.
I JAK attivati fosforilano e attivano le proteine STAT, un trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione. Le STAT attivate traslocano nel nucleo e si legano a specifiche sequenze di DNA, avviando la trascrizione dei geni di risposta antivirale.
Fai crescere le mosche per il periodo desiderato.
L'analisi a valle indica una diminuzione del tasso di sopravvivenza e un aumento della carica virale nei moscerini mutanti Dicer-2.
Per l'infezione virale, in primo luogo, utilizzare uno stereomicroscopio e una pinza sottile per rompere la punta di un ago capillare di vetro al diametro appropriato per la nano-iniezione. Per assemblare l'iniettore, posizionare l'O-ring di tenuta e un distanziatore bianco sullo stantuffo metallico dell'iniettore con la grande fossetta rivolta verso l'esterno.
Utilizzare una siringa dotata di un ago calibro 30 per riempire l'ago di vetro con olio minerale e posizionare l'ago attraverso il colletto. Posizionare l'O-ring più grande attorno alla base del collare, a circa 1 millimetro dall'estremità smussata dell'ago, e montare l'ago sullo stantuffo dell'iniettore.
Fissare l'ago sullo stantuffo e premere il pulsante di svuotamento per estendere lo stantuffo del microiniettore fino a quando non si sente un segnale acustico. Ora premi Fill per ritrarre lo stantuffo di 5 millimetri e immergi l'ago in una sospensione virale di 100 unità che formano placche. Agitare delicatamente uno o almeno tre flaconcini di 20 Drosophila maschio senza Wolbachia sulla piastra per iniezione.
Le mosche con dotazione maschile sono preferite in quanto la variazione ormonale durante l'accoppiamento e la riproduzione può influenzare la lettura con le femmine.
Quindi, iniettare il torace di ciascun moscerino con 50,6 nanolitri di soluzione virale nella regione di colore leggermente più chiaro tra la mesopleura e la tetrapleura e misurare il carico di DCV mediante il test dell'effetto citopatico e la RT-PCR quantitativa dai moscerini terrestri come appena dimostrato. Dopo l'iniezione, trasferire con cura i moscerini in un flaconcino nuovo e posizionare il flaconcino in posizione orizzontale per evitare che i moscerini si attacchino al mezzo durante il recupero dall'anestesia.
Questo studio analizza la risposta antivirale in Drosophila esaminando il ruolo della proteina Dicer-2 nell'elaborazione dell'RNA virale. La ricerca mette in evidenza i meccanismi dell'interferenza dell'RNA e la conseguente risposta immunitaria innescata dalle infezioni virali.
L'iniezione nano precisa di virus nell'addome toracico di Drosophila permette un'analisi controllata delle interazioni ospite-virus e dell'attivazione delle vie immunitarie innate. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistica e la validazione degli obiettivi per le vie di risposta antivirale, fornendo indicazioni per le decisioni iniziali relative al portafoglio di ricerca sulle malattie infettive. Gli output quantitativi di questo modello aumentano la fiducia predittiva per studi traslazionali successivi.
Questo metodo si integra all'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e la validazione preclinica, collegando l'interrogazione del bersaglio genetico con output fenotipici quantitativi.
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Ultimo aggiornamento: 22 agosto 2026