Determinazione della produzione di ROS da parte dei neutrofili in seguito all'interazione con biofilm opsonizzato

I batteri marcati con opsonine sono riconosciuti da specifici recettori neutrofili, innescando la fagocitosi con il rilascio di specie reattive dell'ossigeno, o ROS, e la degradazione batterica.

Per quantificare la produzione di ROS da parte dei neutrofili in vitro, prelevare una piastra a più pozzetti. Il pozzetto del test contiene un biofilm di Staphylococcus aureus composto da batteri incorporati in film di matrice extracellulare. Il pozzetto di controllo è senza biofilm.

Incubare il biofilm con siero umano, consentendo alle opsonine sieriche di opsonizzare il biofilm.

Aspirare il siero. Lavare con tampone, rimuovendo le opsonine non legate. Aggiungi neutrofili e luminolo, un composto chemiluminescente ai pozzetti. Centrifugare, portando i neutrofili vicino al biofilm.

Utilizzando un lettore di piastre, misurare la luminescenza nel tempo.

Nel pozzetto contenente il biofilm, i neutrofili si legano alle opsonine del biofilm, causando l'attivazione dei neutrofili e l'internalizzazione batterica nei fagosomi. Specifiche vie di segnalazione vengono attivate, causando l'assemblaggio della NADPH ossidasi sui fagosomi.

La NADPH ossidasi catalizza il trasferimento di elettroni dal NADPH