Valutazione della colite indotta da sostanze chimiche mediante analisi immunoistochimica di sezioni di tessuto del colon

Nei topi, lo strato mucoso del colon è costituito da cellule immunitarie contenenti lamina propria, circondate da un epitelio strettamente imballato che protegge la mucosa. Il trattamento chimico con destrano solfato di sodio interrompe le giunzioni strette, causando danni alle cellule epiteliali e consentendo ai microbi luminali di penetrare nella lamina propria.

Il riconoscimento microbico nel colon innesca la secrezione di chemochine, portando all'infiltrazione di cellule immunitarie e al rilascio di citochine pro-infiammatorie. Questa risposta immunitaria esagerata provoca infiammazione del colon o colite.

Per valutare la colite indotta da sostanze chimiche, iniziare con un vetrino che trasporta una sezione fissa e pretrattata di tessuto del colon di topo che presenta colite indotta da sostanze chimiche. Trattare la sezione con un cocktail di anticorpi primari specifici per i recettori delle cellule immunitarie che si legano alle rispettive cellule immunitarie.

Lavare per rimuovere gli anticorpi non legati. Incubare la sezione di tessuto con anticorpi secondari biotinilati, che si legano specificamente agli anticorpi primari. Incubare con i coniugati streptavidina-enzima, che interagiscono con le biotine, formando complessi.

Sovrapporre la sezione di tessuto con un substrato cromogenico; l'interazione enzima-substrato conferisce una colorazione marrone alle cellule immunitarie. Controcolorare la sezione con il colorante ematossilina per colorare i nuclei cellulari.

Osservare il vetrino colorato al microscopio. L'abbondanza di cellule immunitarie brune nell'area danneggiata indica una colite indotta da sostanze chimiche.

Per l'analisi immunoistochimica, dopo aver riscaldato le sezioni per 20 minuti sulla piastra calda, lavare i vetrini tre volte in PBS per 10 minuti per lavaggio ed eliminare la perossidasi endogena con un'incubazione di 10 minuti con perossido di idrogeno al 3%.

Al termine dell'incubazione, lavare i campioni tre volte in PBS come dimostrato e bloccare qualsiasi legame aspecifico con tampone bloccante, per almeno un'ora a temperatura ambiente. Quindi, sostituire il tampone bloccante con il cocktail di anticorpi primari di interesse per un'incubazione notturna a 4 gradi Celsius.

La mattina successiva, aspirare la soluzione di anticorpi primari in eccesso e lavare i vetrini tre volte in PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare i vetrini con l'appropriato cocktail di anticorpi secondari biotinilati, seguito dalla marcatura con il complesso di streptavidina perossidasi di rafano a temperatura ambiente.

Per visualizzare le cellule immunoreattive, etichettare i campioni con DAB fino a quando non si sviluppa un colore marrone chiaro o scuro e controcolorare le sezioni con ematossilina e ammoniaca diluita allo 0,3%.

Quando i vetrini si sono asciugati, utilizzare un microscopio ottico per ottenere immagini in campo chiaro delle sezioni di tessuto con un ingrandimento di 10 volte e utilizzare un programma di elaborazione delle immagini per identificare e quantificare la popolazione delle cellule immunitarie marcate sia nell'epitelio che nella lamina propria.