Name: Posizionamento Growth Factor-Coated Perline su embrioni di pollo Stadio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Impara a posizionare perline rivestite con fattori di crescita su embrioni di pollo allo stadio E2.5. Questa tecnica in ovo permette di studiare il destino cellulare e le interazioni proteiche durante lo sviluppo embrionale.

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1. Rimuovere le uova dal incubatore A E2-2.5 (~ S. 17 HH), togliere le uova e preparare di conseguenza. Possono essere lavorato immediatamente o restituite al incubatore per un paio d&#39;ore. Le uova possono essere messi a temperatura ambiente sicuro per più di un&#39;ora. Uova possono rimanere fuori per tutta la durata delle manipolazioni. A volte questi può richiedere un&#39;ora o più. Nota: il più a lungo a temperatura ambiente, meno è probabile che per sopravvivere. 2. Preparazione di china <ol><li> Preparare una soluzione fresca del 4% di inchiostro in India nel PBS sterile. </li><li> Riempire una siringa da 3 ml con la soluzione. </li><li> Mettere un calibro 27, ago ½ pollice sulla siringa. </li><li> Usando un paio di hemostats, piegare l&#39;ago a un angolo di 90 °. </li></ol> 3. Aprendo le uova e l&#39;iniezione di inchiostro di china <ol><li> Usando un paio di pinze, buccia indietro il nastro e aprire la finestra, fissandolo utilizzando il retro del nastro sulla parte posteriore dell&#39;uovo. </li><li> Guida l&#39;ago inclinato fino a quando non si trova appena sotto l&#39;embrione. Ponendo l&#39;ago sotto il disco flottante assicura che l&#39;inchiostro, che è tossico per l&#39;embrione, non verranno in contatto diretto. </li><li> Che devono essere iniettate solo inchiostro sufficiente per creare un contrasto confortevole. Questo è in genere meno di ¼ ml. </li></ol> 4. Apertura del tubo neurale <ol><li> Prendete un paio di forbici dissezione fine e tagliare la sottile membrana che si trova sulla parte superiore, o, talvolta, in giro, l&#39;embrione. </li><li> Prendete una coppia di 55 forcipe o una sonda di tungsteno e aprire il tubo neurale dal anteriore a posteriore. Assicurarsi che l&#39;apertura è grande abbastanza per mettere un tallone in esso. </li></ol> Nota: A seconda dell&#39;età, una sonda di tungsteno multa può essere usato per fare la stessa cosa. 5. Recupero di un rivestimento acrilico eparina-perla <ol><li> Utilizzando una coppia di 55 pinze, trovare un intatto cordone nella soluzione. Lasciare che il cordone si attacca alla punta, chiudere lentamente la pinza. </li><li> Rimuovere il tallone dalla soluzione e portare sopra sopra l&#39;uovo. </li><li> Una volta che il tallone è fuori della sua soluzione, non sarà probabilmente venire fuori fino a quando non è stato messo in albumina. </li></ol> 6. Ponendo il tallone <ol><li> Una volta che il tallone è stata posta sulla parte superiore dell&#39;area di destinazione, utilizzare una sonda di tungsteno per guidarlo verso il prosencefalo o risolvere il problema nel romboencefalo. </li><li> Aggiungere qualche goccia di PBS usando una pipetta 10 L. </li></ol> 7. Chiusura l&#39;uovo <ol><li> Chiudere l&#39;uovo con il sottile pezzo di nastro adesivo per chiudere la finestra. </li><li> Tenuta l&#39;uovo secondo il protocollo durante la preparazione, disponibile all&#39;indirizzo <a href="http://jove.com/index/Details.stp?ID=306" target="_blank">http://jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> . </li></ol>

<ol><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Windowing+Chicken+Eggs+for+Developmental+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies.</a> Jounal of Visualized Experiments. 8, 

 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306">http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306</a> (2007).</li>
<li>Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+expression+of+Fgf8%2C+Otx2%2C+Bmp4%2C+and+Shh+in+the+rostral+prosencephalon+during+development+of+the+telencephalic+and+optic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles.</a> Neuroscience. 108, 183-206 (2001).</li>
<li>Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+regulations+by+FGF8+contribute+to+midbrain+roof+plate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%22%5BJournal%5D)">Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity.</a> Development . 133, 2905-2913 (2006).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

A seconda delle proteine ​​che si desidera utilizzare, ci sono diversi protocolli su come preparare le perline. In questi esperimenti, si usa eparina-acrilico perline, ma affi-gel sfere possono anche essere utilizzati. Abbiamo scoperto che l&#39;eparina-acrilico perle sono più facili da manipolare in ambiente acquoso del ovoalbumina. Le perline vengono immersi in 5 l di proteine ​​durante la notte a 4 ° C. Microsfere di controllo sono posti in PBS sterile fino al momento del collocamento. Il vantaggio nell&#39;utilizzo di uno in preparazion...

<table><tbody><tr><td>Uova</td><td>Animale</td><td></td><td></td><td>Fecondate, E2-2,5 (~ St. 17 HH)</td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>Profi-I</td><td>Lyon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inchiostro di India</td><td>Strumento</td><td>Higgins</td><td></td><td>Preparare una soluzione al 4% in PBS sterile.</td></tr><tr><td>PBS sterile</td><td></td><td></td><td></td><td>In alternativa, può essere utilizzata una miscela di anticorpi</td></tr><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aghi 27G 1/2</td><td>Strumento</td><td>BD Biosciences</td><td>305109</td><td>Inclinati a 90 gradi</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Strumento</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td>misura 55</td></tr><tr><td>Pinze emostatiche</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici da dissezione</td><td>Strumento</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>500086</td><td>vannas, 8,5 cm</td></tr><tr><td>Nastro in parafilm</td><td></td><td></td><td></td><td>per sigillare le uova</td></tr><tr><td>Provetta al tungsteno</td><td>Strumento</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td>Strumento n. 24. L'impugnatura è opzionale.</td></tr></tbody></table>

posizionamento growth factor-coated perline su embrioni di pollo stadio

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

Il tubo neurale esprime molte proteine ​​in specifici modelli di spazio-temporale durante lo sviluppo. Queste proteine ​​hanno dimostrato di essere critica per la determinazione del fato cellulare, la migrazione delle cellule e la formazione dei circuiti neurali. Induzione neuronale e patterning coinvolgere proteina morfogenetica dell&#39;osso (BMP), Sonic hedgehog (SHH), fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), tra gli altri. In particolare, il pattern di espressione di Fgf8 è in prossimità di regioni che esprimono BMP4 e SHH. Questo pattern di espressione è coerente con le interazioni di sviluppo che facilitano patterning nel telencefalo. Qui forniamo una dimostrazione visiva di un metodo in cui un ovo in preparazione può essere usato per testare gli effetti del fgfs nella formazione del prosencefalo. Perle sono rivestiti con proteine ​​e messo nel tubo neurale sviluppo per fornire l&#39;esposizione prolungata. Poiché la procedura utilizza piccoli, perline accuratamente posizionati, è minimamente invasivo e permette sfere diverse da collocare all&#39;interno di un unico tubo neurale. Inoltre, il metodo permette di sviluppo in modo che gli embrioni possono essere analizzati in una fase più matura per rilevare i cambiamenti di anatomia e di patterning neurale. Questo protocollo permette di semplice ma utile per l&#39;imaging in tempo reale. Esso fornisce un mezzo per rendere spazialmente e temporalmente limitate modifiche a livelli di proteine ​​endogene.

Una varietà di fattori di crescita e proteine ​​interagiscono per indurre le cellule ad assumere diversi destini delle cellule durante lo sviluppo. Qui mostriamo l&#39;uso di un ovo in preparazione per affrontare le possibili interazioni tra proteine ​​diverse nello sviluppo, ponendo le perle di E2.5 embrioni di pollo.

Posizionamento Growth Factor-Coated Perline su embrioni di pollo Stadio

Il tubo neurale esprime molte proteine secondo specifici pattern spazio-temporali durante lo sviluppo. È stato dimostrato che tali proteine sono fondamentali per la cell...

Benvenuti nel laboratorio Raburn. Sono Matt Korn, dipartimento di Neurobiologia e Comportamento dell'Università della California di Irvine. Oggi prenderemo un uovo, lo apriremo e inseriremo una perlina precedentemente immersa in un fattore di crescita.La meravigliosa preparazione di un uovo ci permetterà di inserire un fattore di crescita per modificare il destino di diversi tipi di tessuti in questa fase iniziale dello sviluppo embrionale. Giorno due e mezzo, ovvero stadio 17. Ok, siamo qui, al microscopio. Ho le mie uova e tutti i miei strumenti. Quindi, avanti, prenda un uovo qui e può vedere dove si trova il nostro nastro. Sigillante per finestre.Ho questo simpatico piccolo ciambellone. È realizzato semplicemente con argilla artistica che potete trovare in un negozio di articoli per arte. E ora prenderò una coppia di pinzette davvero inadeguata.Questi esistono da molto tempo. Le punte sono piuttosto smussate, ma funzionano bene per sollevare leggermente il nastro in modo che appaia la finestra. Posso posizionarli. Sto semplicemente per piegare questo lembo e riporre l'uovo, questa finestra, dietro in questo modo. Ora posso posizionarlo sotto l'obiettivo e effettuare qualsiasi tipo di manipolazione. In questo caso, lavoreremo con le perline, e procederò subito a prendere la mia inchiostro di India, anche se al momento non ho ancora l'inchiostro di India.Si può notare un piccolo disco embrionale proprio qui, leggermente spostato di lato. Quindi, se ruoto semplicemente l'uovo, riesco a vedere dove parte del sangue sta formando un cerchio qui. E posso procedere prendendo il mio ago con l'inchiostro di India.E ora mi sposterò leggermente di lato qui, andrò al di sotto del disco e c'è un embrione. Non voglio metterne troppo, solo abbastanza da vedere il contrasto dell'embrione rispetto al nero. Poi ruoterò semplicemente questo in modo che la parte dorsale dell'embrione sia rivolta in avanti.E ciò che si può osservare qui è la regione cefalica. Il tubo neurale si estende in questa zona e abbiamo alcuni somiti che ci permettono di determinarne l'età. E se aumento l'ingrandimento, possiamo vedere che il cuore presenta un battito molto lento ma costante, il che è ottimale.Il cuore era lì, ma non batteva. Dovremmo essere un po' preoccupati riguardo al fatto che questo fosse un campione vitale. Poiché non c'è una membrana spessa a coprirlo, posso procedere direttamente con la mia sonda al tungsteno qui.Io, e c'è una membrana sottile, e ora mi sposterò leggermente qui in modo da poter accedere all'embrione. Inseriamo perline nel proencefalo così come nel romboencefalo. E in questo caso, andrò a intervenire sul proencefalo.Ora, per raggiungerlo, devo tagliare attraverso una membrana. Quando gli embrioni sono più giovani, posso semplicemente usare una sonda al tungsteno ed entrare attraverso il tubo neurale, ottenendo così accesso alla regione in cui voglio posizionare la perla. Ora procederò con la mia sonda al tungsteno.E sto usando entrambe le mani solo per stabilizzare la mia mano. Procederò a manovrare l'embrione. Quindi, una volta inserita la perla qui, posso posizionarla direttamente nel tubo neurale e fino al proencefalo.Ok, ora che ho aperto l'embrione, posso proseguire con la preparazione e posizionare la perla. Quindi, inserirò un po' più in profondità la mia sonda per aprire il tubo neurale, come si può vedere ho già fatto. Proseguirò ingrandendo un po' di più l'immagine.Modifico leggermente il mio punto di messa a fuoco qui. E si può notare una bella piccola apertura, ma non ho ancora praticato un foro sopra la zona del cefalone della coda, e questo perché il punto in cui andrà la perlina è proprio lì. Quindi non voglio un foro da cui la perlina potrebbe fuoriuscire.Voglio che sia leggermente arretrato, in modo da poter inserire la perlina e spingerla in avanti. Ora andrò avanti a prendere una perlina. Si può notare che esistono molte dimensioni diverse.Questi sono acrilici eparinizzati, si trovano in PBS. Prenderò un paio di pinze da 55. Come potete vedere, entrerò nel PBS e cercherò semplicemente quello che preferisco.E una volta fuori dal PBS, di solito aderisce alla pinzetta, si può vedere lì. Procedere coprendo le perle. Riportare indietro il mio uovo.Metterò l'uovo a fuoco. Quindi andrò avanti e prenderò il granello con la pinza da 55. È un po' più alto sulla pinza di quanto preferisca, ma va bene così.E ora lo guiderò semplicemente verso il punto in cui ho praticato il foro nel tubo neurale. Una volta inserito nel tubo neurale, diventa facile manipolarlo verso la parte anteriore del cervello in via di sviluppo. Quindi procederò con la mia sonda al tungsteno, spingendola leggermente.Quando si posiziona la perla nel cefalone, è necessario fare attenzione perché, con l'invecchiamento dell'embrione, questo inizierà a piegarsi in avanti e quindi di lato. Spesso accade che, quando si inserisce una perla nel cervello anteriore, ovvero nel cefalone, essa cada verso il becco, poiché il becco si forma nella porzione ventrale dell'embrione, mentre il cervello si trova nella regione dorsale. Tuttavia, in questo caso l'aspetto sembra abbastanza buono.Sono abbastanza soddisfatto di questo risultato. Procederò ora prelevando con una pipetta 10 microlitri di PBS sterile, e ne aggiungerò alcune gocce qui. Ok, ora possiamo procedere a chiudere l'uovo.E quello che farò è semplicemente sollevare qui la finestra, verso l'alto e oltre, e l'uovo non è ancora sigillato. Quindi, per evitare che si secchi, prenderò un pezzo del nastro di plastica che abbiamo usato finora, tagliandone un ritaglio delle dimensioni della finestra, leggermente più grande.E ora la stirerò leggermente, e la posizionerò proprio sopra la finestra qui, assicurandomi che sia ben aderente. In questo modo, tutti i fori che abbiamo praticato, sia durante lo spurgo dell'albume sia durante il taglio della finestra, vengono sigillati. Ora l'uovo è sigillato, non può perdere alcun umore, e non si seccherà.Dovrebbe essere in grado di invecchiare normalmente. Questo è tutto per il posizionamento delle perline. Buona fortuna con i vostri esperimenti sui pulcini, e spero otteniate i risultati desiderati.

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Biologia

Questo video mostra due metodi per la preparazione e l'immissione perline, che sono stati rivestiti con fattore di crescita, su espianti sviluppo della corteccia cerebrale. Queste sfere possono essere utilizzate per indurre l'espressione genica spazialmente limitata nello sviluppo del tessuto neurale come espianti proencefalo. I metodi sono indicati per l'utilizzo di entrambi i Affi-Gel perline e perle di eparina acrilico.

Fattore-Coated crescita Placement Bead su Espianti Forebrain dorsali

Questo video dimostra nuova cultura, un metodo con cui sono coltivati ​​embrioni di pollo al di fuori l'uovo per un massimo di 24 ore. Questo metodo permette di studiare lo sviluppo precoce (stria primitiva a 14 som.), Un periodo corrispondente a E7-9 nel topo. Le applicazioni di questa tecnica sono elettroporazione, ibridazione in situ e immunoistochimica.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

Questo articolo descrive l'etichettatura di superficie...

Monitoraggio Deformazioni tessuto morfogenetica in embrione di pollo primi

Un approccio per l'analisi della migrazione e il destino finale di aviaria cellule della cresta neurale a quaglie-chick embrioni chimera è descritta. Questo metodo è una tecnica semplice e diretto per il tracciamento cellule della cresta neurale durante la migrazione e la differenziazione che sono altrimenti difficili da distinguere all'interno di un embrione di pollo non manipolata.

Analisi della migrazione cresta neurale e la differenziazione delle specie da Cross-trapianto

Visualizzare e accedere all'embrione di pollo durante lo sviluppo può essere impegnativo. Abbiamo sviluppato un metodo ex ovo che è semplice, economico e può essere facilmente utilizzato in classe o in un ambiente di ricerca. Questo metodo consente l'accesso all'embrione nelle fasi avanzate dello sviluppo embrionale (HH 40).

Ottimizzato Ex-ovo Coltura di Chick embrioni a stadi avanzati di sviluppo

Qui segnaliamo la doppia etichettatura delle cellule della cresta neurale e dei vasi sanguigni utilizzando l'innesto intraspecie del tubo neuraleGFP del pulcino combinato con l'iniezione di DiI intra-vascolare. Questa tecnica sperimentale ci permette di visualizzare e studiare contemporaneamente lo sviluppo del sistema nervoso derivato dall'NCC (enterico) e del sistema vascolare, durante l'organogenesi.

Doppia etichettatura delle cellule della cresta neurale e dei vasi sanguigni all'interno degli embrioni di pollo utilizzando l'innesto del tubo neuraleGFP del pulcino e l'iniezione di colorante carbocianina

Innestando perline imbevute di fattori di crescita o inibitori specifici delle vie di segnalazione negli embrioni in via di sviluppo, è possibile testare direttamente i loro effetti in vivo. In questo protocollo, le perle vengono innestate nella gemma dell'arto per determinare gli effetti di queste molecole sull'espressione genica e sulla trasduzione del segnale.

L&#39;innesto di Perline in via di sviluppo di pollo Limbs embrioni per identificare percorsi di trasduzione del segnale che influenzano l&#39;espressione genica

Vengono descritti protocolli che utilizzano barriere impermeabili per bloccare gli eventi di induzione tra i tessuti dell'asse principale del corpo e il fianco nell'embrione di pollo necessari per la formazione degli arti. Le perle imbevute di segnali induttivi candidati vengono utilizzate per superare l'effetto del posizionamento della barriera e l'analisi dell'espressione genica lo conferma.

L&#39;applicazione di barriere impermeabili combinati con un fattore di Candidato Perle Soaked per studiare i segnali induttivi nel Chick

Qui, presentiamo una nuova tecnica per coltivare embrioni di pollo ex ovo per l'imaging time-lapse utilizzando la luce trasmessa e la microscopia a fluorescenza. Il sandwich di carta da filtro sommerso è una variante della consolidata tecnica di supporto della carta da filtro1 che consente la coltura di embrioni di pollo completamente immersi in un terreno di coltura liquido.

Un sommerso Sandwich carta da filtro per il lungo termine Ex Ovo Time-lapse imaging di Chick primi embrioni

In questo metodo, tessuti cardiaci embrionali sono chirurgicamente microdissected, dissociato, fluorescente etichettati e impiantati nei tessuti embrionali dell'ospite. Questo fornisce una piattaforma per lo studio dell'organizzazione inerente allo sviluppo livello individuale o tessuto ectopiche condizioni emodinamiche, e/o alterati paracrine/juxtacrine ambienti.

Sistema basato su microiniezione per In Vivo l'impianto di cardiomiociti embrionali nell'embrione aviaria

Il test del tallone imbevuto prevede la consegna mirata del reagente di prova in qualsiasi momento dello sviluppo per studiare la regolazione della differenziazione cellulare e della morfogenesi. Viene presentato un protocollo dettagliato, applicabile a qualsiasi modello animale sperimentale, per preparare tre diversi tipi di perline imbevute e impiantarle nell'interdigit di un embrione di pollo.

Analisi della differenziazione cellulare, della morfogenesi e del pattern durante l'embriogenesi del pollo utilizzando il test Soaked-Bead

Impara a posizionare perline rivestite con fattori di crescita su embrioni di pollo allo stadio E2.5. Questa tecnica in ovo permette di studiare il destino cellulare e le interazioni proteiche durante lo sviluppo embrionale.

Posizionamento Growth Factor-Coated Perline su embrioni di pollo Stadio

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