Imaging di fase quantitativo tridimensionale per la caratterizzazione di sottotipi di linfociti

Caricare una sospensione di sottotipo linfocitario in una camera di imaging.

Posizionare la camera sul tavolino del microscopio 3D per imaging di fase quantitativa.

Regola i parametri del microscopio e il piano focale per un imaging ottimale.

Durante l'imaging dei linfociti, il raggio laser si divide in fasci di riferimento e di campione.

Il dispositivo digitale a microspecchi, dotato di una serie di microspecchi nel percorso del fascio di campioni, consente al raggio di ruotare di 360 gradi attorno all'asse ottico.

Ogni fascio che passa attraverso il linfocita subisce uno sfasamento basato sulle variazioni dell'indice di rifrazione all'interno della cellula.

Il campione risultante e i raggi di riferimento si ricombinano, formando un ologramma 2D.

Una sequenza di ologrammi contenenti informazioni sulla fase e sull'ampiezza da diverse angolazioni viene catturata attraverso la rotazione del fascio attorno al linfocita.

Acquisisci più ologrammi di sfondo con angoli di illuminazione variabili, esclusi i linfociti.

Utilizzando l'algoritmo di tomografia a diffrazione, ricostruire gli ologrammi in un tomogramma dell'indice di rifrazione 3D, fornendo informazioni morfologiche e biochimiche dei linfociti senza la necessità di etichettatura.

Per un imaging ottimale, diluire ogni campione di cellule a una concentrazione di 180 cellule per microlitro di terreno RPMI e iniettare lentamente 120 microlitri del primo campione diluito in una camera di imaging. Dopo aver confermato la mancanza di bolle all'interno della camera, posizionare una goccia di acqua distillata sulla lente dell'obiettivo di un microscopio a fase quantitativa 3D e posizionare la camera di imaging sul tavolino di traslazione del microscopio. Regolare il tavolino in modo che il campione sia allineato con la lente dell'obiettivo e fare clic su Messa a fuoco e superficie nella scheda Calibrazione della prospettiva del microscopio del software di imaging, per regolare rispettivamente le posizioni assiali dell'obiettivo e delle lenti del condensatore.

Fare clic su Modalità automatica per allineare l'obiettivo e le lenti del condensatore. Per ottimizzare l'allineamento, aprire la modalità di scansione e regolare manualmente le lenti per allineare il modello del dispositivo a microspecchi digitali al centro. Quindi, torna alla modalità normale e regola la fase di traslazione per individuare una cella nel campo visivo. Regolare la posizione assiale della lente dell'obiettivo per trovare il piano focale fino a quando il limite del campione visualizzato sullo schermo non è quasi invisibile.

È importante regolare perfettamente la messa a fuoco della cella per generare un tomogramma RI 3D ottimale. Se l'immagine non viene scattata correttamente, la ricostruzione 3D sarà compromessa, con conseguente rumore del tomogramma.

Regolare la fase di traslazione per trovare una posizione senza una cella e fare clic su Calibra per misurare più ologrammi 2D con angoli di illuminazione variabili. Regolare la fase di traslazione per individuare una cella al centro del campo visivo e, nella scheda Acquisizione, assegnare un nome al campione di cui si sta eseguendo l'immagine.

Fare clic su Istantanea 3D per misurare gli ologrammi della cella utilizzando gli stessi angoli di illuminazione degli ologrammi 2D appena misurati. Quando i dati acquisiti vengono visualizzati nel pannello di gestione dei dati, fare clic con il pulsante destro del mouse su Dati e scegliere Elabora per ricostruire un tomogramma dell'indice di rifrazione 3D dagli ologrammi 2D utilizzando l'algoritmo di tomografia a diffrazione implementato nel software di imaging. Dopo l'imaging, nel pannello Gestione dati, fare clic con il pulsante destro del mouse su Dati e fare clic su Apri per visualizzare i dati.

Fare clic al centro della cella per riposizionarla, quindi fare clic su Tomogramma RI nel pannello Gestione dati. Nella scheda Preimpostato, fare clic su Carica e fare doppio clic su lymphocytes.xml, che è una funzione di trasferimento predefinita fornita dal software di imaging per visualizzare il tomogramma in base alle distribuzioni dell'RI 3D. Scorri il mouse per ingrandire e trascina la cella per ruotarla in qualsiasi direzione.