Name: Misurazione della carica batterica e Risposte immunitarie in topi infettati con Listeria monocytogenes /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 50 s
Description: Impara a misurare la carica batterica e le risposte immunitarie in topi infettati con Listeria monocytogenes. Questo metodo consente l'analisi FACS delle sospensioni cellulari e la caratterizzazione delle differenze tra ceppi suscettibili e resistenti.

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Gli autori desiderano ringraziare Anna Walduck, Christina Cheers, Stuart Berzins, Dale Godfrey, Yifan Zhan e Jonathan Wilksch per consigli e reagenti. Questo lavoro è stato finanziato dalla Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) e la salute Australian National and Medical Research Council (575.552). NO è supportato da un premio post-laurea australiano. OW è supportato da una Wright RD Fellowship della Australian National Health Medical Research Council.

<ol><li>Wing, E. J., Gregory, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+clinical+and+experimental+update%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: clinical and experimental update.</a> J Infect Dis. 185, Suppl 1. S18-S24 (2002).</li>
<li>Conlan, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+host-pathogen+interactions+in+the+liver+and+spleen+during+systemic+murine+listeriosis%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Early host-pathogen interactions in the liver and spleen during systemic murine listeriosis: an overview.</a> Immunobiology. 201, 178-187 (1999).</li>
<li>Neuenhahn, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+functions+of+splenic+CD8alpha%2B+dendritic+cells+during+infection+with+intracellular+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Unique functions of splenic CD8alpha+ dendritic cells during infection with intracellular pathogens.</a> Immunol Lett. 114, 66-72 (2007).</li>
<li>Cousens, L. P., Wing, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+defenses+in+the+liver+during+Listeria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate defenses in the liver during Listeria infection.</a> Immunol Rev. 174, 150-159 (2000).</li>
<li>Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes%3A+a+multifaceted+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes: a multifaceted model.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).</li>
<li>Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune responses to Listeria monocytogenes.</a> Nat Rev Immunol. 4, 812-823 (2004).</li>
<li>Cheers, C., McKenzie, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+and+susceptibility+of+mice+to+bacterial+infection%3A+genetics+of+listeriosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Resistance and susceptibility of mice to bacterial infection: genetics of listeriosis.</a> Infect Immun. 19, 755-762 (1978).</li>
<li>Garifulin, O., Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+as+a+probe+of+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomic+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes as a probe of immune function.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 4, 258-269 (2005).</li>
<li>Gervais, F., Stevenson, M., Skamene, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+resistance+to+Listeria+monocytogenes%3A+regulation+of+leukocyte+inflammatory+responses+by+the+Hc+locus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of resistance to Listeria monocytogenes: regulation of leukocyte inflammatory responses by the Hc locus.</a> J Immunol. 132, 2078-2083 (1984).</li>
<li>Gervais, F., Desforges, C., Skamene, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C5-sufficient+A%2FJ+congenic+mouse+strain.+Inflammatory+response+and+resistance+to+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The C5-sufficient A/J congenic mouse strain. Inflammatory response and resistance to Listeria monocytogenes.</a> J Immunol. 142, 2057-2060 (1989).</li>
<li>Boyartchuk, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multigenic+control+of+Listeria+monocytogenes+susceptibility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Multigenic control of Listeria monocytogenes susceptibility in mice.</a> Nat Genet. 27, 259-260 (2001).</li>
<li>Boyartchuk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+resistance+locus+sst1+controls+innate+immunity+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The host resistance locus sst1 controls innate immunity to Listeria monocytogenes infection in immunodeficient mice.</a> J Immunol. 173, 5112-5120 (2004).</li>
<li>Pan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ipr1+gene+mediates+innate+immunity+to+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ipr1 gene mediates innate immunity to tuberculosis.</a> Nature. 434, 767-772 (2005).</li>
<li>Garifulin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irf3+polymorphism+alters+induction+of+interferon+beta+in+response+to+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Irf3 polymorphism alters induction of interferon beta in response to Listeria monocytogenes infection.</a> PLoS Genet. 3, 1587-1597 (2007).</li>
<li>Hof, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+different+strains+of+Listeria+monocytogenes+serovar+1%2F2a%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Microbiol+Immunol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar 1/2a.</a> Med Microbiol Immunol (Berl. 173, 207-218 (1984).</li>
<li>Wollert, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+host+range+of+Listeria+monocytogenes+by+rational+protein+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design.</a> Cell. 129, 891-902 (2007).</li>
<li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+model+for+listeriosis%3A+role+of+internalin+in+crossing+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier.</a> Science. 292, 1722-1725 (2001).</li>
<li>Marco, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penetration+of+Listeria+monocytogenes+in+mice+infected+by+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route.</a> Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).</li>
<li>Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+for+infection+with+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Animal model for infection with Listeria monocytogenes.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).</li>
<li>Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+in+mouse+models+of+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DCs in mouse models of intracellular bacterial infection.</a> Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).</li>
<li>Conlan, J. W., North, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+are+essential+for+early+anti-Listeria+defense+in+the+liver%2C+but+not+in+the+spleen+or+peritoneal+cavity%2C+as+revealed+by+a+granulocyte-depleting+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 179, 259-268 (1994).</li>
<li>Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+antigranulocyte+monoclonal+antibody+RB6-8C5+prevents+expression+of+acquired+resistance+to+Listeria+monocytogenes+infection+in+previously+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice.</a> Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Listeria è uno degli organismi più utilizzati per caratterizzare le risposte immunitarie dell'ospite nei confronti di batteri intracellulari6. Il protocollo qui presentato consente di misurare il carico batterico e le risposte delle cellule immunitarie nello stesso tessuto di un singolo topo. Questa doppia misurazione su un tessuto specifico per ciascun topo infetto permette confronti più robusti all'interno e tra coorti di topi (rappresentanti ceppi diversi o diversi tempi post-infezione). Sebbene l'infezione da Listeria per via orale possa essere utilizzata per studiare le risposte immunitarie nei topi, l'infezione per via endovenosa è spesso preferita perché: 1) garantisce un rilascio rapido ed efficace nel torrente sanguigno; 2) determina un'infezione sistemica sincronizzata e costante; e 3) la specie Mus presenta una mutazione nel gene che codifica per il recettore E-caderina, la quale limita l'infezione da Listeria per via orale (questa mutazione compromette la capacità di Listeria di legare il recettore E-caderina del topo e di attraversare in modo efficiente la barriera epiteliale del tratto gastrointestinale)16-18.
In questo protocollo esistono alcuni passaggi critici. In primo luogo, il ceppo iniziale di Listeria deve essere ottenuto da una coltura fresca su HBA incubata per tutta la notte, per garantire vitalità e virulenza. In secondo luogo, è importante determinare con precisione la concentrazione di UFC dell'inoculo prima e dopo l'iniezione in tutti i topi, per assicurare che la concentrazione di UFC non differisca notevolmente tra il primo e l'ultimo topo inoculato. In terzo luogo, l'iniezione di Listeria nella vena della coda deve essere eseguita in maniera uniforme per tutti i topi. Infine, è necessario effettuare la perfusione del fegato per eliminare i leucociti non residenti, al fine di garantire una misurazione accurata delle cellule immunitarie presenti nel fegato e non dei leucociti in transito nel sangue periferico. Tutti questi passaggi, se non eseguiti correttamente, possono causare una variabilità indesiderata nel carico batterico e/o nelle risposte immunitarie tra i singoli topi infettati con Listeria.
Due limitazioni di questo protocollo sono l'abilità dell'investigatore nell'iniettare i topi per via endovenosa e la rilevazione del carico batterico nei tessuti. Se una stessa persona deve iniettare un elevato numero di topi, la vitalità di Listeria (ovvero la concentrazione di UFC) potrebbe ridursi nel tempo una volta scongelato l'inoculo (ad esempio &gt;2 ore tra l'iniezione del primo e dell'ultimo topo). Spetta all'investigatore stabilire quanti topi è in grado di iniettare prima che l'inoculo risulti compromesso. Un'altra limitazione di questo metodo è che il carico di Listeria non può essere misurato con precisione al di sotto di 100UFC/organos a causa delle relativamente piccole quantità di omogenato tissutale coltivato (ad esempio la Figura 3 indica che 100UFC/organos rappresenta il limite di rilevazione). Per misurare con maggiore accuratezza valori inferiori di UFC/organos, si può coltivare una quantità maggiore di omogenato tissutale (fino a 0,5 mL per piastra, possono essere utilizzate più piastre), in modo da campionare una frazione maggiore del tessuto per la rilevazione di Listeria. Se non è disponibile uno Stomacher, allora metodi alternativi per omogeneizzare il tessuto, come l'utilizzo di un omogeneizzatore tissutale, possono essere impiegati al posto dei passaggi 7.1-7.2. Dal punto di vista pratico, se lo spazio nell'incubatrice a 37°C è limitato per la coltivazione dei campioni tissutali provenienti da topi infetti, le piastre di agar HBA possono essere incubate a temperatura ambiente per 2-3 giorni (le colonie cresceranno più lentamente a temperatura ambiente). Tuttavia, la temperatura ambiente non deve essere utilizzata quando si coltivano ceppi per la preparazione di scorte congelate di Listeria.
Questo protocollo fornisce un approccio di base per caratterizzare l'infezione da Listeria nei topi ed è utilizzabile con ceppi di Listeria diversi dall'EGD. Oltre al fegato e alla milza, possono essere ottenute sospensioni monocellulari anche dai linfonodi. In entrambi i casi, queste sospensioni monocellulari possono essere impiegate per diverse analisi, tra cui la quantificazione dei sottogruppi di cellule immunitarie e la stimolazione in vitro di cellule immunitarie precedentemente ordinate. Una volta acquisite le tecniche di base, il protocollo può essere modificato per isolare linfociti T specifici per Listeria19, caratterizzare le cellule dendritiche20 o eseguire l'esaurimento delle cellule immunitarie in determinati momenti successivi all'infezione21,22, al fine di caratterizzare in modo più approfondito la risposta immunitaria nei topi infettati da Listeria.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Cavallo agar sangue di base n.2 </td><td> Oxoid </td><td> CM0271 </td><td> Preparazione di base per piastre di agar HBA </td></tr><tr><td> Cavallo sangue (defibrinato) </td><td> Oxoid </td><td> HB1000 </td><td> Aggiungi 5-10% a base di agar </td></tr><tr><td> Cervello infusione cuore (BHI) brodo (10 ml) </td><td> Oxoid </td><td> TM456 </td><td></td></tr><tr><td> Cervello cuore dei media infusione disidratati </td><td> Oxoid </td><td> CM1135 </td><td></td></tr><tr><td> 96 pozzetti fondo piatto </td><td> BD Biosciences </td><td> 353072 </td><td></td></tr><tr><td> 70 micron filtro cellulare </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Piccola scatola di Petri </td><td> BD Biosciences </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Stomacher 80 BIOMASTER laboratorio di sistema </td><td> Seward </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stomacher sacchetti di plastica </td><td> Sarstedt </td><td> 86 9924 530 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td></td></tr><tr><td> FACS tampone </td><td></td><td></td><td> 0,1% (w / v) di BSA in PBS </td></tr><tr><td> Isotonica Percoll (33,75 Percoll% in PBS) </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, 62.5mL 1x PBS fa 100 ml Percoll isotonico </td></tr><tr><td> TAC Buffer </td><td></td><td></td><td> 17mm Tris, cloruro di ammonio 140mm in acqua distillata </td></tr><tr><td> FCS / EDTA buffer di </td><td></td><td></td><td> Siero di vitello fetale con 10mM EDTA </td></tr><tr><td> FACS / EDTA buffer di </td><td></td><td></td><td> FACS tampone + 5mM EDTA </td></tr><tr><td> Blu tripano </td><td> Sigma </td><td> T6146 </td><td> 0,4% (w / v) in PBS, filtro sterilizzato </td></tr><tr><td> 2 ml provetta Microbank ™ </td><td> Greiner Bio One </td><td> 121263 </td><td></td></tr><tr><td> 27 siringa da insulina gauge/1mL </td><td> Terumo Medical Products </td><td> SS10M2713 </td><td></td></tr><tr><td> Ago </td><td> Terumo Medical Products </td><td> NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in) </td><td></td></tr><tr><td> Siringa </td><td> Terumo Medical Products </td><td> SS-01T (1 ml), SS-053 (5 ml), SS-10S (10 ml) </td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione della carica batterica e risposte immunitarie in topi infettati con listeria monocytogenes</em

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (listeria) è un batterio Gram-positivo patogeno intracellulare facoltativo 1. Studi sul topo tipicamente impiegano iniezione endovenosa di Listeria, che si traduce in infezione sistemica 2. Dopo l&#39;iniezione, Listeria diffonde rapidamente alla milza e al fegato a causa di assorbimento da parte CD8α + cellule dendritiche e le cellule di Kupffer 3,4. Una volta fagocitati, varie proteine ​​batteriche Listeria consentono di sfuggire alla phagosome, sopravvivono all&#39;interno del citosol, e infettare le cellule vicine 5. Durante i primi tre giorni di infezione, le cellule differenti immunitario innato (es. monociti, neutrofili, cellule NK, cellule dendritiche) mediare i meccanismi battericida che riducono al minimo la proliferazione di Listeria. Cellule T CD8 + vengono successivamente assunti e responsabile per la liquidazione finale di Listeria dal host, in genere entro 10 giorni di infezione 6. Distanza di successo di Listeria da topi infettati dipende l&#39;insorgenza appropriato di risposta immunitaria 6. Vi è un&#39;ampia gamma di sensibilità tra i ceppi di topi inbred 7,8. In genere, i topi con una maggiore suscettibilità alle infezioni da Listeria sono meno in grado di controllare la proliferazione batterica, dimostrando una maggiore carica batterica e / o clearance ritardata rispetto ai topi resistenti. Studi genetici, comprese le analisi di linkage e ceppi di topi knockout, hanno identificato i geni diversi per i quali variazione di sequenza colpisce risposte serie alle infezioni da Listeria 6,8-14. Determinazione e confronto delle cinetiche di infezione tra i diversi ceppi di topi è quindi un importante metodo per identificare i fattori dell&#39;ospite genetici che contribuiscono alla risposta immunitaria contro Listeria. Confronto di risposte serie a diversi ceppi di Listeria è anche un modo efficace per identificare fattori di virulenza dei batteri che possono servire come potenziali bersagli per la terapia antibiotica o la progettazione di vaccini. Descriviamo qui un metodo semplice per la misurazione della carica batterica (unità formanti colonia [CFU] tessuto per persona) e la preparazione a cella singola sospensioni del fegato e della milza per l&#39;analisi FACS delle risposte immunitarie in topi infettati con Listeria. Questo metodo è particolarmente utile per la caratterizzazione iniziale di infezione da Listeria in ceppi di topi romanzo, così come il confronto delle risposte immunitarie tra diversi ceppi di topi infettati con Listeria. Usiamo il Listeria monocytogenes EGD ceppo 15 che, se coltivati ​​su agar sangue, presenta una zona caratteristica alone intorno ad ogni colonia a causa di β-emolisi 1 (Figura 1). Carica batterica e le risposte immunitarie possono essere determinati in qualsiasi momento-point dopo l&#39;infezione da tessuto omogenato coltura su piastre di agar sangue e la preparazione delle sospensioni di cellule di tessuto per l&#39;analisi FACS utilizzando i protocolli descritti di seguito. Si segnala che gli individui immunocompromessi o in stato di gravidanza non devono maneggiare Listeria, e il comitato di biosicurezza istituzionali competenti e facility management animale deve essere consultato prima dei lavori.

Listeria monocytogenes è un organismo modello per studiare le risposte immunitarie e la suscettibilità genetica a batteri intracellulari nei topi. Questo metodo permette di misurare la carica batterica e di generare monocellulari sospensioni del fegato e della milza di topi per l&#39;analisi FACS per determinare cambiamenti nelle cellule del sistema immunitario dovuta a infezione da Listeria.

Misurazione della carica batterica e Risposte immunitarie in topi infettati con Listeria monocytogenes</em

*Listeria monocytogenes* (Listeria) è un patogeno intracellulare facoltativo Gram-positivo1. Gli studi su modelli murini impiegano tipicamente l'iniezione endovenosa di...

Questo video illustra un metodo per misurare il carico batterico e generare nonché analizzare sospensioni di singole cellule provenienti da fegato e milza di topo. Innanzitutto, viene preparato un inocularlo di listeria e iniettato per via endovenosa nei topi. Successivamente, sangue, fegato e milza vengono prelevati da topi sacrificati in punti temporali scelti.Le sospensioni di singole cellule vengono preparate da tessuti raccolti e da omogeneati di tessuto AC coltivati su piastre di agar sangue equino. Le sospensioni cellulari risultanti possono quindi essere analizzate per valutarne la vitalità e il contenuto di cellule immunitarie mediante analisi FACS, mentre il carico batterico viene determinato in base alle unità formanti colonie. Questo metodo può aiutare a caratterizzare le risposte immunitarie all'infezione da steroidi, come ad esempio quelle tra ceppi malati suscettibili e resistenti, determinando contemporaneamente il carico batterico negli organi infetti.Iniziare questa procedura preparando l'inoculo di Listeria alla concentrazione desiderata; le istruzioni per la coltivazione, conservazione e preparazione di Listeria sono disponibili nel protocollo scritto allegato. Una volta pronto l'inoculo, trasferire due aliquote di 100 microlitri in provette microfuse sterili contenenti 900 microlitri di PBS per ottenere una diluizione uno a 10; quindi trasferire 100 microlitri di ciascuna diluizione su piastre di agar sangue equino (HBA) e distribuire accuratamente con un’ansa sterile per eseguire il conteggio delle unità formanti colonie (CFU); successivamente, incubare le piastre capovolte a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Successivamente, trasferire i topi in una gabbia pulita.Posizionare la gabbia a 50 centimetri sotto una lampada a infrarossi da 250 watt per cinque minuti per assicurare la dilatazione della vena caudale. Questo permette una migliore visualizzazione durante l'iniezione; qui, il ceppo di topo resistente alla listeria, C57 black six, e il ceppo di topo suscettibile alla listeria. Valvola C: mescolare delicatamente la sospensione di listeria capovolgendo il tubo alcune volte.Quindi caricare una siringa da un millilitro con un ago da 27 gauge per l’iniezione di 200 microlitri per topo. Assicurarsi che eventuali bolle d’aria presenti nella siringa vengano eliminate prima dell’iniezione. Posizionare il topo in un dispositivo di contenimento.Quindi localizzare la vena caudale laterale del topo identificando prima l'arteria caudale, situata al centro del lato dorsale. Ruotare leggermente la coda verso il lato laterale per identificare la vena. Pulire delicatamente la coda con un disinfettante al 70% di etanolo, quindi iniettare dopo aver ritirato la siringa.Applicare brevemente pressione sulla ferita di entrata con un quadratino di garza sterile. Si noti che è molto più difficile identificare la vena della coda nei topi di colore nero dopo l'iniezione. Restituire il topo alla gabbia dopo aver iniettato tutti i topi della piastra e incubare il residuo dell'inoculo per il conteggio delle unità formanti colonie.Come in precedenza, il giorno successivo, contare il numero di colonie e determinare le concentrazioni dell'inoculo di Listeria prima e dopo l'iniezione. L'alone caratteristico che circonda le singole colonie, mostrato qui, è dovuto all'emolisi beta. Una volta determinati i conteggi prima e dopo l'iniezione, calcolare la media delle unità formanti colonie sommando i valori delle unità formanti colonie prima e dopo l'iniezione e dividendo per due.Infine, in diversi momenti successivi all'iniezione, raccogliere il sangue ed estrarre fegato e milza da topi sottoposti a eutanasia. Se si intende eseguire un'analisi fax, il fegato deve essere perfuso prima del prelievo per ottenere il sangue; eseguire quindi un'emorragia cardiaca immediatamente dopo l'eutanasia e raccogliere la maggior quantità possibile di sangue in un'apposita provetta di raccolta. Per perfondere il fegato, innanzitutto aprire la cavità addominale ed estrarre e scartare la cistifellea.La vena cava inferiore è una vena che corre parallela alla colonna vertebrale e trasporta il sangue dalla parte inferiore del corpo, inclusi il fegato, al cuore. Utilizzando un paio di forbici, recidere la vena appena al di sotto del cuore per creare un'uscita attraverso cui il fluido di perfusione possa defluire. Successivamente, ruotare i lobi epatici verso la testa e spostare l'intestino verso destra per esporre la vena porta epatica, che entra nella parte inferiore del fegato.Dal lato inferiore destro, inserire un ago curvo di mezzo pollice, calibro 26, nella vena porta epatica e iniettare 10 millilitri di PBS. Dopo aver iniettato uno o due millilitri di PBS, il fegato passerà da un colore rosso scuro a un marrone chiaro. La soluzione iniettata uscirà dalla vena cava inferiore recisa. La perfusione epatica garantisce che le cellule raccolte provengano dal fegato e non dal sangue circolante.Successivamente, rimuovere il fegato perfuso dalla cavità corporea del mouse e immergerlo nel tubo contenente il buffer facts posto sul ghiaccio. Quindi rimuovere la milza e posizionarla sul ghiaccio per essere processata in modo analogo a quanto descritto nella prossima sezione. Per ottenere sospensioni cellulari epatiche singole a partire dal fegato, iniziare trasferendo il fegato perfuso dal buffer fax a un filtro cellulare da 70 micron posizionato all'interno di una piastra di Petri da 60 millimetri.Utilizzando lo stantuffo di una siringa da cinque litri, spingere il tessuto attraverso il filtro cellulare nella piastra di Petri. Trasferire la sospensione monocellulare in un tubo conico da 50 millilitri con tappo a vite e portare il volume finale a 40 millilitri con buffer fax freddo.Vortexare la sospensione cellulare. Quindi prelevare un'aliquote di un millilitro per la determinazione del carico batterico. Successivamente nel procedimento, posizionare il tubo da 50 millilitri nella centrifuga e pellettizzare le cellule centrifugando a 500 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Dopo aver scartato il soprannatante, ripetere questo passaggio di lavaggio risospendendo il pellet in 40 millilitri di tampone fax freddo e centrifugando. Ancora una volta, risospendere. Sospendere il pellet in 20 millilitri di soluzione isotonica per pozzetto a temperatura ambiente e centrifugare la sospensione cellulare a 700 ×g per 12 minuti a temperatura ambiente.Dopo la centrifugazione, un foglio di forma discoidale di epatociti galleggerà sulla superficie del percoll, mentre i leucociti rimarranno pellettizzati sul fondo del tubo; scartare lo strato di epatociti e il percoll versandoli in un contenitore per rifiuti. Successivamente, risospendere il pellet contenente i leucociti in quattro millilitri di buffer TAC per lisare gli eritrociti e incubare le cellule a temperatura ambiente fino a 10 minuti, con inversioni frequenti. Al termine dell'incubazione, filtrare la sospensione cellulare attraverso una membrana in nylon da 100 micron in un nuovo tubo da centrifuga da 10 millilitri.Sottostrato della sospensione cellulare filtrata con un millilitro di tampone fax EDTA come mostrato qui. Quindi centrifugare a 350 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, risospendere in cinque millilitri di tampone fax EDTA, quindi centrifugare nuovamente e risospendere il pellet in 0,5-3 millilitri di tampone fax EDTA, a seconda delle dimensioni del pellet; determinare il numero di leucociti epatici vitali utilizzando un emocitometro basato sull'esclusione del blu di triam.Le sospensioni di singole cellule possono quindi essere marcate con anticorpi specifici per i marcatori di superficie cellulare desiderati e analizzate mediante facts. Una volta generate le sospensioni di singole cellule a partire dal tessuto epatico e splenico, i carichi batterici verranno determinati per alcune parti della procedura. Una macchina per omogeneizzare lo stomaco verrà utilizzata per omogeneizzare il tessuto, tenendo chiusa una borsa gastrica ER per prevenire perdite.Cominciare appoggiandola piatta su un banco pulito. Arrotolare una penna spessa e rotonda sul tessuto fino a quando il tessuto non è schiacciato all'interno del sacchetto. Aggiungere cinque millilitri di PBS in ogni sacchetto stomaco contenente il tessuto schiacciato.Posizionare lo stomaco o i sacchetti nello stomaco e far funzionare alla massima velocità per 10 minuti. La macchina stomacale è dotata di due pale che comprimono lo stomaco o i sacchetti a una velocità specificata, mescolando il contenuto fino a ottenere un omogeneato uniforme e contenendo eventuali aerosol. Utilizzando una pipetta, mescolare l'omogeneato all'interno del sacchetto. Successivamente, trasferire 300 microlitri in duplicato su una piastra da 96 pozzetti con fondo piatto.All'interno delle pozzette della piastra a 96 pozzette, eseguire un'accurata diluizione seriale da 1 a 10 fino a una diluizione di 10 alla cinque. Per ogni campione di omogenato tissutale, utilizzare con attenzione un’asticella sterile per distribuire 0,1 millilitri di ciascuna diluizione su una piastra HBA pre-essiccata. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per tutta la notte.Il giorno successivo, contare il numero di unità formanti colonie per ogni diluizione e calcolare le unità formanti colonie per tessuto, tenendo conto della porzione di tessuto, dei fattori di diluizione e del volume dell'omogenato. Per verificare se i topi C 57 black six fossero infettati con circa 2000 unità formanti colonie di *Listeria* a tre e sette giorni dall'infezione, i topi sono stati soppressi e il fegato è stato perfuso ed estratto insieme al milza. Le diluizioni dell'omogenato splenico o della sospensione cellulare epatica sono state coltivate su piastre HBA per determinare il carico batterico.Nel risultato mostrato qui, la linea tratteggiata indica il limite di rilevamento a 100 unità formanti colonie per organo. Si noti che il carico di listeria è maggiore al terzo giorno rispetto al settimo giorno. Questo perché entro il settimo giorno, diverse cellule immunitarie portano all'eliminazione della listeria.In questi due tessuti, milza e fegato, le sospensioni cellulari singole sono state colorate con blu di trian e caricate su un emo. Il citometro conterà le cellule all'interno dell'area di conteggio indicata nel riquadro rosso. Le cellule non vitali assorbiranno il blu di trian e appariranno blu, mentre le cellule vitali rimarranno incolori.Come mostrato qui, il numero di cellule vitali nella milza, riportato a sinistra, e il numero di leucociti vitali nel fegato, riportato a destra, aumenta durante il decorso dell'infezione. Questo incremento è dovuto alle cellule immunitarie, inclusi neutrofili e linfociti, che si attivano, proliferano e migrano verso questi due siti di infezione. A titolo esemplificativo dei livelli di cellule immunitarie durante il decorso dell'infezione da listeria, vengono mostrati qui grafici rappresentativi di citofluorimetria e il numero di cellule T positive per CD8.Il numero di cellule T CD8 positive diminuisce temporaneamente a causa della linfopenia nella milza nei giorni due-tre, per poi aumentare in modo significativo a partire dal giorno cinque post-infezione sia nella milza che nel fegato. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'oscillazione degli androgeni, l'analisi delle cellule T specifiche per l'antigene e saggi funzionali delle cellule immunitarie ordinate, al fine di caratterizzare ulteriormente le risposte immunitarie all'infezione da Listeria.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Lo, B.C., et al. Fibrosi intestinale indotta da Salmonella cronica. J. Vis. Esp. (2019)Il video dimostra la quantificazione del carico batterico in un modello murino di infezione cronica da Salmonella typhimurium resistente alla streptomicina. Dopo l'eutanasia e la dissezione sterile, i tessuti cecali e splenici vengono prelevati, omogeneizzati con perle d'acciaio per rilasciare batteri e diluiti in serie di teste. Le diluizioni vengono placcate su agar selettivo e le colonie visibili...

Quantificazione del carico batterico tissutale in un modello murino di infezione intestinale cronica

Fonte: McMullen, P. D., Freitag, N. E. Valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca in topi infetti utilizzando Listeria monocytogenes. J. Vis. Esp. (2015)Questo video mostra l'iniezione di Listeria monocytogenes nella vena caudale di un topo per stabilire un'infezione sistemica. Mostra la circolazione batterica, la colonizzazione degli organi e la quantificazione del carico batterico nel cuore omogeneizzando i tessuti, eseguendo diluizioni...

Quantificazione del carico batterico nel cuore del topo dopo l'iniezione nella vena caudale di Listeria monocytogenes

Source: Ahn, J. J., et al. Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates bacterial load measurement in spleen and liver tissues isolated from mice infected with an intracellular bacterial pathogen. Bacteria, accumulated within tissue-resident phagocytes during systemic infection, are released using detergent-based lysis and mechanical disruption. Serial dilutions of the homogenates are plated on...

Quantification of Bacterial Load in Mouse Spleen and Liver After Systemic Infection

Source: Ahn, J. J., et al., Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-γ Responses. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the preparation of mouse splenocyte cultures from Listeria monocytogenes-infected mice for downstream cytokine analysis. It includes ex vivo bacteria-derived antigen stimulation and sample processing to study T cell responses.

In Vitro Stimulation of Mouse Splenocytes with Heat-Killed Listeria monocytogenes

Questo video dimostra la quantificazione della carica batterica infettiva dal cervello di topo perfuso infettato da Listeria monocytogenes.

Valutazione della colonizzazione batterica in un cervello di topo a seguito di infezione da Listeria monocytogenes

Questo documento descrive un nuovo metodo per l'infezione orale di topi...

Trasmissione orale di<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Nei topi tramite ingestione di alimenti contaminati

La listeria monocytogenes causa infezioni fetali nelle donne in gravidanza e meningite nelle popolazioni sensibili.  Le sottopopolazioni di batteri possono colonizzare il tessuto cardiaco, causando miocardite in pazienti e animali da laboratorio.  Qui presentiamo un protocollo che descrive come valutare l'invasione delle cellule cardiache di L. monocytogenes in vitro e la colonizzazione cardiaca negli animali infetti.

Valutazione dell'invasione batterica delle cellule cardiache in coltura e colonizzazione cardiaca nei topi infetti utilizzando listeria monocytogenes

Questo protocollo descrive come inoculare topi C57BL / 6J con il ceppo EGD di Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) e per misurare l'interferone-γ (IFN-γ) risposte da parte delle cellule natural killer (NK), cellule T natural killer (NKT), e adattiva linfociti T dopo l'infezione. Questo protocollo descrive anche come condurre studi di sopravvivenza in topi dopo l'infezione con una versione modificata del DL 50 dosi del patogeno.

Infezione sperimentale con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Come modello per lo studio Host Interferone-gamma Risposte

Durante l'infezione, la Listeria monocytogenes è in grado di attraversare la barriera ematomeningea per colonizzare il cervello. In questo protocollo, dimostriamo come valutare la colonizzazione batterica degli organi a seguito di infezione dei topi. È disponibile una procedura per eseguire perfusione d'organo intero per determinazione specifica di numeri batterici nel parenchima del cervello.

Listeria monocytogenes Infezione del cervello

Descriviamo entrambe le analisi in vitro e in vivo di infezione che possono essere utilizzate per analizzare le attività dei fattori ospite-codifica.

Utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello Host

Qui presentiamo un elegante protocollo per la valutazione in vivo di vaccino efficacia e host le risposte immunitarie. Questo protocollo può essere adattato per i modelli di vaccino che studiano virale, batterica o parassitari patogeni.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Impara a misurare la carica batterica e le risposte immunitarie in topi infettati con Listeria monocytogenes. Questo metodo consente l'analisi FACS delle sospensioni cellulari e la caratterizzazione delle differenze tra ceppi suscettibili e resistenti.

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