Rat mesentere angiogenesi Assay

Benvenuti al Dipartimento di Anatomia Patologica dell'Ospedale Universitario di GaN a Guttenburg, in Svezia. Sono il dottor Klaus Norby, e il metodo che state per vedere è stato sviluppato nel mio laboratorio. L'angiogenesi clinicamente rilevante, che si verifica in connessione con ipossia, tumori solidi o qualsiasi altra patologia angiogenetica, avviene quasi esclusivamente in tessuti normalmente vascolarizzati. Nei piccoli roditori adulti, il mesentere, che collega l'intestino tenue alla parete posteriore del corpo, contiene numerose parti sottili e membranose. Nei ratti, esistono circa da 40 a 50 di queste finestre mesenteriche. Sono praticamente trasparenti e quindi simili a finestre ad occhio nudo; ogni finestra è circondata da tessuto adiposo nei ratti maschi adulti.

Le finestre mesenteriche sono fisiologicamente vascolarizzate e non presentano angiogenesi fisiologica misurabile. Esse offrono quindi l'opportunità di studiare l'angiogenesi *de novo* in tessuti mammiferi adulti fisiologicamente vascolarizzati. Cioè, l'avvio di una risposta angiogenica completa da zero, superando gli inibitori dell'angiogenesi che agiscono endogenamente nel tessuto in esame, come in tutti i tessuti normali nei topi; i microvasi nativi che potrebbero fungere da vasi progenitori sono assenti in molte finestre, il che purtroppo rende il saggio imprevedibile nei topi nella sua forma nativa.

Le finestre mesenteriche nei ratti contengono normalmente un numero relativamente ridotto di piccoli vasi sanguigni situati alla periferia nei ratti adulti. Queste finestre mesenteriche hanno uno spessore nativo compreso tra cinque e dieci micrometri. Ciò consente di stendere il tessuto intatto su vetrini e di osservarlo al microscopio, permettendo così di visualizzare tutti i vasi in ogni finestra e conferendo ai vasi stessi un'estensione sostanzialmente bidimensionale.

Il metodo offre un'opportunità senza pari per effettuare misurazioni quantitative dell'estensione spaziale, della densità, della formazione di schemi e delle dimensioni dei microvasi sanguigni. Il sito sottocutaneo è comunemente utilizzato negli studi sull'angiogenesi; tuttavia, a causa dell'eterogeneità delle cellule endoteliali e delle proprietà specifiche dei tessuti, il controllo dell'angiogenesi nei tessuti sottocutanei e nei tumori in crescita sottocutanea potrebbe non prevedere il controllo dell'angiogenesi negli organi viscerali metastatici come polmone, fegato, osso e cervello. Ciò è degno di nota poiché le metastasi viscerali sono solitamente responsabili della letalità del cancro.

Il fatto che la finestra mesenterica sia viscerale dovrebbe essere vantaggioso a questo riguardo. L'obiettivo del nostro progetto è studiare quantitativamente gli aspetti dell'angiogenesi de novo. Pertanto, inoculiamo un fattore pro-angiogenico consolidato o una sostanza in esame per via intraperitoneale.

Normalmente iniettiamo cinque millilitri alla volta in ratti adulti non anestetizzati. Un volume di questo tipo espone rapidamente l'intero mesentere al liquido iniettato. Qualsiasi soluzione iniettata per via intraperitoneale, purché il suo volume non sia minimo, dovrebbe interessare tutte le cellule del tessuto in esame, specialmente considerando che lo strato mesoteliale di cellule che ricopre la finestra mesenterica estremamente sottile è altamente permeabile ai soluti; poiché non è previsto alcun intervento chirurgico, l'angiogenesi da studiare nella finestra mesenterica non è influenzata da un'angiogenesi indotta dalla guarigione delle ferite, quindi il trattamento angiogenico viene somministrato sotto forma di iniezioni intraperitoneali.

Per ragioni pratiche, utilizziamo un protocollo di trattamento che prevede due iniezioni giornaliere per un periodo di cinque giorni, da lunedì mattina a venerdì mattina, come standard nello studio degli effetti angiogenici di proteine definite come VEGF 1 65, 1 64 e FGF basico, ad esempio. Solitamente si utilizza come veicolo la soluzione per infusione Pharmacia. Il numero di trattamenti può apparire elevato, ma è stato dimostrato che non è sempre possibile indurre un'angiogenesi statisticamente significativa anche quando si utilizzano fattori pro-angiogenici potenti come VEGF e FGF basico, somministrati a livelli approssimativamente fisiologici in un'unica dose o in poche dosi distanziate; va ricordato che nel tessuto operano potenti inibitori endogeni dell'angiogenesi.

L'amministrazione di modalità terapeutiche che modulano l'angiogenesi imita una situazione terapeutica clinica. Uno o più fattori che modulano l'angiogenesi possono essere somministrati per via sistemica, sottocutanea, endovenosa o orale. Ad esempio.

Questo simula una situazione di trattamento clinico, poiché è possibile studiare non solo l'effetto della molecola madre, ma anche quello dei suoi metaboliti. Il sistema permette un certo grado di controllo sugli effetti tossici di agenti modulatori dell'angiogenesi somministrati per via sistemica. Poiché i ratti adulti crescono fisiologicamente e possono aumentare di peso di circa il 40% durante un esperimento della durata di due o tre settimane, è possibile, pesando gli animali, valutare in che misura il trattamento abbia rallentato l'aumento di peso corporeo, che può essere considerato un indicatore degli effetti tossici.

Questo consente di evitare dosi tossiche di sostanze testate che modulano l'angiogenesi. Un vantaggio importante, poiché potrebbe risultare impossibile interpretare i risultati in termini di effetti anti-angiogenici specifici. Se è presente un effetto tossico, considerato che i ratti adulti crescono notevolmente più velocemente dei topi adulti, l'effetto degli agenti tossici sull'aumento di peso corporeo dovrebbe rappresentare un indicatore più sensibile degli effetti tossici generali nei ratti rispetto ai topi.

Ora vorremmo mostrarvi come si preparano i campioni di finestra mesenterica. Questi animali sono stati soppressi utilizzando CO2. Le finestre mesenteriche vengono distese su normali vetrini plus di dimensioni tre per un pollice, partendo dalla porzione distale del mesentere.

Non è possibile osservare l'angiogenesi ad occhio nudo nella finestra mesenterica, partendo dalla valvola ileocecale e procedendo in direzione retrograda. Si utilizzano le quattro finestre prelevate dalla parte più distale del mesentere. Il campione sul vetrino viene essiccato a temperatura ambiente per 20 minuti.

Il moncone intestinale viene asportato. I campioni vengono quindi conservati in un congelatore a meno 20 gradi centigradi. In questo modo, i campioni possono essere mantenuti per diversi mesi, forse anche anni, senza un deterioramento pronunciato della qualità.

La colorazione viene eseguita utilizzando un anticorpo monoclonale contro l'endotelio di ratto; lasciare asciugare il campione all'aria, non montare con vetrino coprioggetto. La quantificazione degli episodi di vasi sanguigni in singole finestre mesenteriche viene effettuata mediante microscopia morfometrica assistita da computer, utilizzando un microscopio disegnatore con un ingrandimento ottico totale compreso tra 14 e 34. L'intera finestra mesenterica viene visualizzata.

L'ingrandimento viene scelto in passaggi fissi in modo da coprire con la massima estensione possibile il campo visivo con il campione. L'intera area della finestra è facilmente rappresentabile poiché il confine tra la finestra e il tessuto adiposo circostante è ben definito. Tutte le parti vascolarizzate vengono quindi disegnate secondo criteri attentamente definiti.

È possibile distinguere chiaramente anche i più piccoli vasi sanguigni appena formati, il cui diametro, a ingrandimenti più elevati, risulta essere di circa 2,5-3,0 micrometri. Il fatto che il diametro medio dell'eritrocita del ratto sia pari o superiore a 6,3 micrometri evidenzia quanto siano piccoli questi vasi. L'area di tutte le parti vascolarizzate in una finestra, espressa come percentuale dell'area dell'intera finestra, è nota come area vascolarizzata relativa va.

È sostanzialmente una misura dell'estensione spaziale dei vasi, che presentano un'estensione essenzialmente bidimensionale; l'area vascolare (VA) può quindi essere facilmente misurata mediante telemetria assistita da computer, ad esempio. Il passo successivo consiste nel registrare la densità dei microvasi e la formazione del loro schema all'interno di tre parti centrali delle aree vascolarizzate di ogni finestra. Queste parti vengono scelte sistematicamente in modo casuale a un ingrandimento ottico di 80.

Ogni vaso viene visualizzato come una singola linea utilizzando un microscopio disegnatore. L'immagine di ogni campo visivo viene trasferita in un'immagine digitalizzata e in un analizzatore di immagini, e ogni vaso nell'immagine digitalizzata viene quindi ridotto a uno spessore di un pixel. La macchina misura quindi il numero di pixel, che rappresenta i vasi e viene espresso come frazione di tutti i pixel presenti nel campo visivo.

Questo valore percentuale, la lunghezza microvascolare o MVL, rappresenta la lunghezza dei microvasi in ogni unità di area vascolarizzata ed è una misura composita della densità dei microvasi. Moltiplicando il valore medio di VA di quattro campi per animale per il valore medio di MVL del corrispondente gruppo di trattamento, si calcola la lunghezza totale microvascolare per animale, TMVL. Abbiamo inoltre sviluppato tecniche per l'analisi quantitativa dettagliata della densità e della composizione dei microvasi mediante analisi delle immagini.

Questi includono la misurazione della distanza effettiva tra due microvasi successivi, i punti di biforcazione, IE, la lunghezza dei singoli microvasi, i segmenti LEMS, il numero di microvasi, i segmenti per unità di volume del tessuto, NOMS e il numero di punti di biforcazione dei microvasi per unità di volume del tessuto. NOBP. Il grado di tortuosità nei microvasi MVT è dato dalla differenza tra la distanza più breve e la distanza effettiva tra due punti di biforcazione successivi, dalla presenza di microvasi che si incrociano, indicato dall'indice di intersezione INIS, e dalla formazione di anelli interconnessi. L'indice di formazione degli anelli INLF può essere misurato con precisione utilizzando tecniche simili alla periferia della rete di microvasi.

Siamo inoltre in grado di quantificare le variabili corrispondenti per i germogli, inclusa la lunghezza dei germogli, LESP, e il numero di germogli per unità di volume del tessuto, NOSP, progettando esperimenti poiché possono esistere differenze significative tra animali dello stesso gruppo di trattamento e persino tra finestre mesenteriche nello stesso animale. Abbiamo riscontrato che il seguente disegno può rivelarsi pratico: il numero di animali per gruppo di trattamento nel periodo di osservazione, da otto a dodici; il numero di finestre per animale analizzate in termini di VA; il numero di campi visivi per ciascuna finestra analizzata in termini di lunghezza microvascolare, MVL; lunghezza dei microvasi, segmenti, LEMS; numero di segmenti microvascolari, NOMS; numero di punti di biforcazione dei microvasi, NOBP; tortuosità dei microvasi, MVT; indice di intersezione, I; indice di formazione di anelli, INF. Tre animali trattati con veicolo vengono utilizzati come controlli. Il saggio di angiogenesi della finestra mesenterica è particolarmente adatto per studi sull'effetto dose e per analisi cinetiche dell'angiogenesi.

Questo può essere fatto trattando gruppi di animali con diverse dosi di un fattore pro-angiogenico e sacrificando questi animali in diversi momenti temporali durante la risposta angiogenica. La fase espansiva, il picco e la successiva fase angio- regressiva possono così essere distinte in termini quantitativi. Studi di questo tipo hanno rivelato che la risposta angiogenica *de novo* a qualsiasi citochina fattore di crescita testata è specificamente dipendente dalla dose in termini di velocità, potenza e durata.

Inoltre, il modello dei nuovi vasi in termini di estensione spaziale e modifiche nei microvasi e nella densità è spesso marcatamente dipendente dalla dose e dal tempo, rispetto all'angiogenesi mediata da VEGF o da FGF basico a dosi approssimativamente fisiologiche. L'angiogenesi mediata dai mastociti, MCMA indotta mediante attivazione selettiva dei mastociti in situ, presenta una potenza notevolmente maggiore e una durata eccezionalmente più lunga. In effetti, l'angiogenesi mediata dai mastociti è stata descritta per la prima volta utilizzando questo saggio, grazie alla capacità di quantificare variabili oggettive di angiogenesi, all'elevato grado di rilevanza biologica del sistema e alla possibilità di verificare l'eventuale tossicità del trattamento.

La metodologia è particolarmente adatta per analisi di struttura-attività e di risposta alla dose. Il MWAA nel ratto presenta un modello per lo studio dell'angiogenesi in un tessuto viscerale vascolarizzato nativamente nell'adulto, che non presenta angiogenesi fisiologica ed è non influenzato da interventi chirurgici, escludendo così qualsiasi effetto dovuto all'angiogenesi indotta dalla guarigione delle ferite. Il saggio è veramente quantitativo e valuta con precisione un numero di variabili oggettive biologicamente rilevanti che descrivono l'estensione spaziale, la densità e la formazione del pattern dei microvasi.

Il saggio è particolarmente adatto per lo studio degli effetti sistemici dell'angiogenesi, dei fattori modulatori e per ricerche sulla relazione struttura-attività e sulla risposta dose-effetto. La metodologia qui descritta è stata sviluppata presso il laboratorio del dottor Kloss Carl Norby del Dipartimento di Anatomia Patologica dell'Ospedale Universitario Reka, Università di Göteborg, Jute Borg, in Svezia. Tutti gli studi di questo progetto sono stati finanziati dal Consiglio Svedese per la Ricerca Medica, numero del progetto 5 9 4 2.

Si ringrazia per l'abile assistenza tecnica della signora Gun Effer, coinvolta fin dall'inizio del progetto, della signorina Monica Anderson, non presente, e della signora Ann Nemar Lindgren.

Spero che questa breve presentazione ti abbia dato un'idea del potenziale del saggio. Se utilizzi questo saggio nel tuo laboratorio, sarò lieto di assisterti qualora tu incontrassi qualsiasi problema tecnico. Apprezzerò inoltre molto qualsiasi suggerimento tu possa avere.

Grazie.