Immunoistochimica: sezioni di paraffina Utilizzando il Vectastain ABC Kit Labs Vector

Ciao, sono Victor Chi e sono uno studente laureato presso il Chandy Lab del Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California Irvine. Oggi dimostrerò come colorare le sezioni incorporate in paraffina utilizzando il kit A b, C di Vector Laboratories. Questa procedura prevede la decerazione e l'idratazione di sezioni incluse in paraffina, l'esecuzione del recupero dell'antigene indotto dal calore per smascherare gli antigeni, bloccare la perossidasi e il legame di proteine non specifiche, incubare con CD quattro e tirosina idrossilasi e anticorpi secondari e sviluppare e montare il vetrino.

Quindi iniziamo. Poiché i vetrini sono codificati in paraffina, il primo passo è quello di decerare i vetrini. Questo viene fatto di solito in una cappa aspirante utilizzando tre barattoli di xilene dopo tre lavaggi composti da cinque minuti per ogni lavaggio.

I vetrini vengono quindi inseriti in etanolo al cento per cento. Noterai che la cera sui vetrini è sparita, ma fai attenzione a non maneggiare i vetrini con i guanti perché lo xilene dissolverà la gomma dei guanti. Da lì, si trasportano i vetrini nell'etanolo al cento per cento in laboratorio dove subiranno un gradiente di idratazione.

Quindi qui vi parlerò del gradiente di idratazione che passerà attraverso le nostre diapositive. Si inizia con due bagni di etanolo al cento per cento. Da lì, trasferiamo i nostri scivoli in due bagni costituiti al 95% da etanolo.

Quindi trasferiamo i nostri vetrini in un bagno di etanolo al 70% e da lì trasferiamo i nostri vetrini in un bagno di etanolo al 50%. Dopodiché, trasferiamo i nostri vetrini al 30% di etanolo e due minuti dopo trasferiamo i nostri vetrini in acqua distillata doppia. E dopo il trattamento con acqua distillata doppia, lasceremo riposare il nostro scivolo in PBS.

Quindi ora vi mostrerò come trasportare gli scivoli da un bagno all'altro nelle carrozze. Quindi il primo passo è utilizzare il supporto del carrello, rimuovere le guide e raschiare delicatamente per rimuovere il liquido in eccesso in modo da non portare troppo liquido al bagno successivo. Da lì, immergilo e attendi due minuti fino al prossimo cambio di pendenza.

Tante volte, quando i tessuti si fissano, l'antigene viene mascherato in modo che l'anticorpo non possa legarsi ad esso. Quindi quello che farò ora è mostrarvi un metodo di recupero dell'antigene indotto dal calore utilizzando il citrato di sodio. Quindi ora siamo qui al microonde dove smaschererò il mio antigene CD otto, di cui cercherò di rilevare usando l'immunoistochimica.

E qui metterò la mia soluzione e la metterò nel microonde per 15 minuti. Quindi faremo bollire il nostro citrato di sodio con i nostri vetrini per 15 minuti per assicurarci che i nostri vetrini non si secchino. Guarderemo i nostri vetrini in modo che dopo l'ebollizione riempiremo di citrato di sodio per assicurarci che rimangano idratati.

Quindi, prima di mettere i vetrini nel citrato di sodio, ho già preriscaldato la mia soluzione per 45 secondi. Poi ho messo i miei vetrini nel citrato di sodio e ora sto riscaldando il mio citrato di sodio per 15 minuti. Con le diapositive al suo interno, di solito la soluzione inizia a bollire a circa due o due minuti e mezzo dall'inizio del processo di ebollizione.

A quel punto, mi fermerò e sostituirò il citrato di sodio perso con citrato di sodio fresco. Dopo aver fatto bollire il citrato di sodio per 15 minuti, vogliamo rimuovere i nostri vetrini e la soluzione e raffreddarli. E quindi il modo migliore per farlo è tappare il supporto per vetrini, versare il liquido in eccesso e farlo scorrere su un getto di acqua fredda fino a quando la soluzione all'interno del barattolo non si è raffreddata a temperatura ambiente.

E questo di solito richiede dai 10 ai 15 minuti. Quindi, dopo aver rimosso i nostri vetrini dal lavandino, dobbiamo bloccare l'attività endogena della perossidasi nei tessuti. Quindi, quello che faremo è fare una soluzione di perossido di idrogeno utilizzando il 30% di perossido di idrogeno e costituendo una soluzione di perossido di idrogeno all'1%.

E da qui, trasferisco i vetrini direttamente nella soluzione di perossido di idrogeno. E ora incuberemo i nostri vetrini nel perossido di idrogeno per 20 minuti. Ora, dopo che sono trascorsi 20 minuti, dopo aver bloccato la perossidasi endogena, laverò via il perossido di idrogeno dai vetrini usando lavaggi di PBS.

Quindi trasferirò le mie diapositive sulla carrozza e la laverò con tre lavaggi composti da cinque minuti ciascuno. Quindi questi vetrini sono stati posizionati uno dietro l'altro per evitare il contatto con gli altri vetrini che potrebbero danneggiare il tessuto. Quindi sto semplicemente scivolando via dai vetrini e sto sistemando i vetrini in modo che il tessuto non abbia la possibilità di entrare in contatto con il vetro.

Lì trasferiamo le nostre diapositive su PBS. Quindi, dopo aver lavato i nostri vetrini con PBS, ora bloccherò i vetrini per il legame non specifico delle proteine con una soluzione di siero di capra al 5% di BSA al 5% e di azide di sodio allo 0,1%. Quindi vuoi cambiare il siero di capra con un'altra specie se stai lavorando con anticorpi di capra.

Quindi, in questo momento, metterò le diapositive nel nostro supporto per diapositive e lo riempirò con la nostra soluzione. Quindi normalmente lo riempio a metà in modo che il volume dei vetrini assicuri che i tessuti siano sommersi. Quindi una cosa di cui vuoi assicurarti quando metti i vetrini nel contenitore è evitare che questi tessuti tocchino i lati del contenitore.

Quindi, per l'ultimo vetrino, ruotalo verso l'interno in modo che il fazzoletto non tocchi il contenitore. Quindi, ora che ho bloccato i miei vetrini durante la notte, laverò via la soluzione bloccante in eccesso con tre lavaggi da cinque, composti da cinque minuti in PBS. Quindi, a questo punto, vogliamo disegnare un cerchio usando un bloccante liquido attorno al nostro tessuto in modo da ridurre al minimo la quantità di anticorpi utilizzati.

Se non si è preoccupati della conservazione degli anticorpi, è sempre possibile incubare i vetrini negli stessi involucri in cui è stata eseguita la fase di blocco. Quindi, da questo punto in poi, vi mostrerò come disegniamo con il bloccante liquido intorno al nostro tessuto. Quindi per prima cosa rimuoviamo il sangue dal liquido in eccesso, facendo attenzione a non toccare il tessuto.

Quindi basta strofinare agli angoli per rimuovere il liquido in eccesso. Ancora una volta, stando molto, molto attenti a non toccare il fazzoletto. Prendi il perno di blocco del liquido, premi delicatamente per far partire il flusso e da lì, circonda il fazzoletto con la penna.

Lasciare asciugare il bloccante di liquidi per circa 15 secondi. A questo punto, vogliamo aggiungere l'anticorpo primario. Quindi, utilizzando una pipetta, assicurati di coprire il tessuto con il tuo anticorpo primario e di trasferirlo nella tua scatola a umidità controllata.

Quindi usiamo un wipe Kim. Sposare con un po' d'acqua in questa scatola per evitare che il vetrino si secchi poiché è in incubazione con l'anticorpo primario. Ora che il nostro anticorpo primario è stato in incubazione per un'ora, rimuoveremo i nostri vetrini e laveremo via l'anticorpo in eccesso con PBS.

Quindi, ancora una volta, lascia defluire il liquido e inseriscilo nel tuo lavaggio PBS. E ancora, lavare tre volte per cinque minuti. Quindi, dopo i nostri tre lavaggi di cinque minuti, aggiungeremo il nostro anticorpo secondario al nostro tessuto nello stesso modo in cui abbiamo aggiunto il nostro anticorpo primario.

Quindi, usando un volume sufficiente per coprire i tessuti, aggiungi il tuo anticorpo secondario, che stiamo usando come capra anti coniglio, e sposta il vetrino di nuovo nella camera a umidità controllata. E quindi stiamo usando un anticorpo secondario, che è la capra biotinilata anti coniglio, che è essenziale quando si utilizza il metodo A BC. Quindi trasferiamo il nostro vetrino nella camera a umidità controllata e lasciamo che incubi per una fuori.

Quindi, mentre l'anticorpo secondario è in incubazione, dobbiamo preparare il reagente A BC. Quindi stiamo usando i laboratori di vettori, reagenti A, B, C del kit di colorazione del vettore. Quindi rimuovi il reagente e lascialo cadere tre volte in 15 millilitri di PBS facendo attenzione a non schiacciare il tubo perché le gocce devono essere specificamente dosate e di una dimensione specifica.

Quindi, dopo che l'anticorpo secondario è stato incubato per circa un'ora, si prendono i vetrini e li si lava di nuovo nel PBS, proprio come si è fatto con l'anticorpo primario. Quindi, dopo tre lavaggi di cinque minuti ciascuno, si trasferiscono i vetrini in questo contenitore dove si aggiunge il reagente A, B, C, che si è preparato da 30 a 45 minuti prima. E quindi basta aggiungere il reagente A, B, C qui e riempire i vetrini e lasciarlo incubare per altri 30-45 minuti.

Quindi, dopo che i vetrini sono rimasti in a, B, C per circa 34-5 minuti, vogliamo lavare via la soluzione A, B, C in eccesso. Quindi basta rimuovere le diapositive e aggiungerle alla soluzione PBS. E quindi vogliamo ripetere la stessa procedura di lavaggio tre volte in PBS per cinque minuti ogni lavaggio.

Mentre i vetrini vengono lavati, preparo il substrato DAB perossidasi da laboratori vettoriali. Prendo il tampone pH 7,5 e aggiungo due gocce. Dopo il tampone pH 7,5, prendo il reagente di reazione del substrato DAB e ne aggiungo due gocce.

Anche in questo caso, la dimensione della goccia è fondamentale, quindi non schiacciare la bottiglia e lasciare che le gocce cadano. Due gocce per tampone pH 7,5. Quindi si desidera aggiungere quattro gocce del reagente del substrato DAB, lasciandolo cadere anche lui.

Si desidera aggiungere anche alla fine, si desidera aggiungere due gocce del reagente del substrato di perossido di idrogeno. Ecco come dovrebbe apparire la miscela di reagenti del substrato DAB. Ora è pronto per aggiungere alle diapositive, rimuovere le diapositive e consentire al PBS di scaricare le diapositive.

Quindi, nel tempo, il reagente DAB diventa più marrone. Quindi vogliamo aggiungerlo alle nostre diapositive a questo punto. Quindi prendi abbastanza volume da coprire i tessuti e aggiungilo direttamente sui campioni di tessuto.

Quindi basta prendere il volume appropriato e aggiungerlo direttamente sopra i campioni di tessuto e lasciare che la soluzione si sviluppi poiché i campioni di tessuto dovrebbero diventare più marroni dopo il tempo. Dopo aver aggiunto la soluzione DAB, si può vedere in questa sezione del cervello dove il tessuto diventa marrone qua e là. Il DAB marrone in piedi rivela la regione contenente i neuroni dopaminergici del mesencefalo.

Dopo aver sviluppato le tue diapositive da due a 10 minuti, vuoi aggiungere le tue, quindi vuoi aggiungere le tue diapositive all'acqua ghiacciata per fermare la reazione. Quindi lascia defluire la soluzione e aggiungi i tuoi vetrini direttamente nell'acqua ghiacciata. Dopo aver immerso gli scivoli nell'acqua ghiacciata, porta la vasca nel lavandino e fai scorrere l'acqua fredda per circa cinque minuti per assicurarti che tutta la soluzione DAB venga scaricata da questa vasca.

Quindi, quando aggiungi il lavandino, fai attenzione a non lasciare che il flusso colpisca il fazzoletto e piuttosto a colpirlo in uno degli angoli e lasciarlo traboccare in modo che i tuoi tessuti non siano disturbati dal flusso d'acqua. Quindi, dopo aver rimosso le diapositive dal lavaggio, vuoi fare una macchia da banco. Allora perché potresti volere una macchia da banco?

Beh, uno dei motivi è che potresti voler vedere la struttura del tuo tessuto. Un altro è visualizzare tutte le cellule. Quindi, per i nostri scopi, contrasteremo la colorazione con hemat toin, che sta per nuclei.

Quindi vogliamo semplicemente prendere i nostri vetrini, rimuovere il liquido in eccesso e immergerlo una volta nella soluzione di ematina emat. Uno, tiralo fuori e aggiungilo direttamente nell'acqua. Dopo aver aggiunto i tuoi scivoli nell'acqua del rubinetto, vuoi prendere i tuoi scivoli e farli scorrere sott'acqua, proprio come hai fatto in precedenza con il bagno di acqua ghiacciata.

Quindi, per il lavaggio dell'hemat Toin, lascialo scorrere sotto l'acqua corrente fino a quando l'acqua all'interno del barattolo non diventa limpida. Quindi, dopo aver rimosso dall'acqua i nostri scivoli macchiati di bancone, vogliamo disidratare nuovamente i nostri scivoli. E quindi vogliamo rimetterlo attraverso il nostro gradiente di etanolo, ma in ordine inverso.

Quindi sarebbe un lavaggio con acqua deionizzata, un lavaggio con etanolo al 30%, un lavaggio con etanolo al 50%, un lavaggio con etanolo al 70%, due lavaggi e etanolo al 95% e due lavaggi e etanolo al 100% ciascuno composto da due minuti ciascuno. Quindi rimuovi i vetrini, rimuovi il liquido in eccesso e aggiungilo direttamente al tuo etanolo al 30% e lascialo riposare per due minuti. Quindi, dopo l'ultimo lavaggio con etanolo al cento per cento, vogliamo rimettere i vetrini nello xilene.

Quindi riprendete le diapositive, raschiando via il liquido in eccesso, prendete le diapositive e aggiungetele al primo xilene per cinque minuti. Quindi saranno tre lavaggi consecutivi con xilene per cinque minuti ciascuno. E ora siamo pronti per montare le nostre diapositive.

Quindi quello che faccio di solito è un minuto prima che i vetrini siano pronti, prendo la mia pipetta da pascolo e disegno la soluzione per il montaggio della permanente, e lascio che vada circa un minuto prima che i miei vetrini siano pronti per uscire Dopo l'ultimo lavaggio dello xilene, facendo attenzione a non immergere i guanti o bagnarli con xilene, Rimuovili con un paio di pinzette facendo attenzione a quale lato contiene il fazzoletto. Rimuovere delicatamente l'eccesso di XLE con una salvietta Kim, facendo attenzione a non toccare il fazzoletto, basta strofinare accuratamente agli angoli e ai bordi, lasciando evaporare la maggior parte dello xilene. Probabilmente puoi lavorare su due diapositive prima che una si asciughi.

Quindi, quando hai finito di asciugare un vetrino, l'altro vetrino dovrebbe essere pronto per funzionare. Ora devi lavorare con loro prima che si secchino completamente. Quindi vuoi prendere il tuo perimonte e tracciare una linea sottile vicino al tuo tessuto, facendo attenzione a non toccare il tuo tessuto.

Rimuovi il perimount prendendo il tuo vetrino coprioggetti. Applicalo con un angolo di 45 gradi e lascialo piegare verso il basso. E poi fai scorrere il vetrino coprioggetti, assicurandoti che il perimount copra tutti i tessuti.

Stendere quindi l'olio, adagiarlo e premere delicatamente al centro per eliminare tutte le bolle d'aria in eccesso. Lasciarlo asciugare mentre si lavora sul secondo fazzoletto è il momento di guardare le nostre diapositive, non in realtà. Quindi dobbiamo lasciare asciugare la montatura permanente durante la notte prima di guardare le nostre diapositive.

Altrimenti, sotto la luce del microscopio, la montatura permanente bolle e quindi si rovina il campione. Ecco uno sguardo alle nostre sezioni cerebrali dopo la colorazione con sostanze chimiche, anticorpo policlonale di coniglio diretto contro la tirosina idrossilasi. Ancora una volta, la colorazione marrone DAB mostra la posizione dei neuroni dopaminergici del mesencefalo.

La colorazione del contatore dell'ematina trasforma tutti i nuclei di questo tessuto in blu. Quindi ti ho appena mostrato come colorare le sezioni incorporate nella paraffina utilizzando il kit A BC di Vector Laboratories. Ora ti consigliamo di regolare le condizioni in base ai tipi di tessuto che colorerai e agli anticorpi che utilizzerai.

Quindi buona fortuna per i tuoi esperimenti.