Generazione di varianti di fuga dal virus dell'influenza contro gli anticorpi neutralizzanti

Prendi una sospensione del virus dell'influenza, contenente sia ceppi wild-type che mutanti.

Una glicoproteina dell'involucro virale chiamata emoagglutinina, o HA, si lega all'acido sialico sulla superficie della cellula ospite, mediando l'ingresso virale.

Aggiungere un anticorpo neutralizzante in concentrazioni decrescenti che si lega all'HA, bloccando il sito di legame dell'acido sialico.

I ceppi mutanti, portatori di mutazioni nell'HA che aiutano a evitare la neutralizzazione degli anticorpi, sono chiamati varianti di fuga.

Iniettare la miscela in uova di gallina embrionate prive di agenti patogeni, rilasciando i virus nel liquido allantoideo, e incubare.

I

virus neutralizzati dagli anticorpi non possono entrare nelle cellule della membrana corioallantoidea. I virus mutanti non neutralizzati entrano nelle cellule, si replicano e vengono rilasciati nel liquido allantoico.

Raccogliere il liquido allantoico contenente la popolazione virale.

Introdurre un anticorpo specifico per l'HA in concentrazioni decrescenti, che neutralizza gli altri ceppi ad eccezione delle varianti di fuga.

Introdurre i globuli rossi di pollo o RBC. Le varianti di fuga non neutralizzate si legano alle cellule, causando l'aggregazione dei globuli rossi, chiamata emoagglutinazione, confermando la generazione della variante di fuga.

Gli anticorpi neutralizzanti che hanno attività HI vengono ulteriormente analizzati preparando prima 4 diluizioni dell'anticorpo di interesse in concentrazioni crescenti in 1 volte PBS in un volume di 100 microlitri per diluizione. Successivamente, preparare una scorta virale di 1 milione di unità formanti placca per millilitro in 1 volte PBS in un volume di 400 microlitri.

Quindi, mescolare 100 microlitri di 1 milione di unità formanti placche per millilitro di virus con 100 microlitri di ciascuna diluizione anticorpale o 100 microlitri di 1 volte PBS. Incubare i campioni per un'ora in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Dopo un breve vortice, iniettare 200 microlitri di ciascuna miscela in uova di gallina embrionate specifiche prive di agenti patogeni. Quindi, incubare le uova a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica per 40-44 ore. Dopo l'incubazione, sacrificare gli ovuli embrionali infetti infetti dal virus ponendoli a 4 gradi Celsius per un minimo di 6 ore. Successivamente, raccogli il liquido allantoideo dalle uova come descritto in precedenza.

Infine, confermare le varianti di fuga eseguendo il test HI come descritto nel protocollo di testo.