Un test basato su cellule per valutare l'assorbimento della proteina tau da parte della microglia

Inizia con una piastra a fondo piatto contenente microglia murina aderita, cellule fagocitiche nel cervello.

Introdurre un terreno privo di siero contenente immunocomplessi. Questi complessi sono costituiti da anticorpi attaccati ad aggregati proteici Tau fosforilati, che si formano durante alcune malattie neurodegenerative.

Gli aggregati Tau sono marcati con un colorante fluorescente verde sensibile al pH.

Durante l'incubazione, questi immunocomplessi interagiscono con i recettori Fc delle cellule microgliali, facilitandone l'inghiottimento.

Questo endosoma contenente immunocomplessi si fonde con un lisosoma, formando un endolisosoma. L'ambiente acido dell'endolisosoma provoca la fluorescenza delle molecole del colorante.

Lavare per rimuovere gli immunocomplessi non internalizzati.

Trattare con una soluzione di tripsina-EDTA per staccare le cellule.

Trasferire la sospensione cellulare su una piastra con fondo a U posizionata sopra il ghiaccio per stabilizzare l'endolisosoma. Pellettare le celle e scartare il surnatante.

Lavare e risospendere le celle con il tampone FACS.

Utilizzando FACS, identificare le singole cellule vive e quantificare l'intensità della fluorescenza verde per valutare l'assorbimento di Tau da parte della microglia.

Il primo giorno dell'esperimento preparare le cellule BV-2 lavandole prima con 1x PBS nel pallone in cui sono state coltivate. Quindi, incubarli con tripsina EDTA allo 0,05% a 37 gradi Celsius e 5% CO₂ fino a quando non si staccano dal pallone. Risospendere le cellule nel terreno di coltura pipettando su e giù da 3 a 5 volte.

Contare le cellule e preparare una sospensione cellulare con una concentrazione finale di 100.000 cellule per millilitro in terreno di coltura contenente 200 microgrammi per millilitro di eparina. Aggiungere 250 microlitri di questa sospensione cellulare per pozzetto in una piastra a fondo piatto per coltura tissutale a 96 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di CO₂ durante la notte.

Dopo aver scongelato gli aggregati di colorante pH Tau precedentemente preparati su ghiaccio, diluirli in 65 microlitri per condizione di terreno privo di siero per ottenere una soluzione a 500 nanomolari. Diluire gli anticorpi in 65 microlitri di terreno privo di siero per ottenere il doppio della concentrazione desiderata. Miscelare gli aggregati di colorante Tau pH e gli anticorpi in una piastra con fondo a U a 96 pozzetti. Sigillare questa piastra di diluizione e incubare per una notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, rimuovere il terreno dalla piastra a 96 pozzetti con le celle BV-2. Lavare le celle in ogni pozzetto con 100 microlitri di temperatura ambiente 1x PBS. Rimuovere il PBS dalla piastra cellulare BV-2. Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 125 microlitri di immunocomplessi dalla piastra di diluizione a ciascun pozzetto di una piastra cellulare BV-2 a 96 pozzetti e incubare per due ore a 37 gradi Celsius con il 5% di CO₂.

Dopo l'incubazione, rimuovere gli immunocomplessi dalle cellule e lavare le cellule in ogni pozzetto con 100 microlitri di temperatura ambiente 1x PBS. Dopo aver rimosso 1x PBS, aggiungere 50 microlitri di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare per 20 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di CO₂. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura e risospendere il pozzetto pipettando su e giù per staccare le cellule.

Trasferire le celle in una piastra con fondo a U a 96 pozzetti e centrifugarla a 400 volte g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Posizionare il piatto sul ghiaccio e rimuovere il mezzo. Aggiungere 150 microlitri di 1x PBS ghiacciato e centrifugare nuovamente a 400 g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Mettere la piastra sul ghiaccio e lavare nuovamente rimuovendo 1x PBS precedentemente aggiunto e aggiungendo 150 microlitri di PBS ghiacciato per pozzetto. Centrifugare nuovamente nelle stesse condizioni.

Posizionare la piastra sul ghiaccio e lavare le cellule rimuovendo il PBS precedentemente aggiunto e aggiungendo 150 microlitri di tampone FACS per pozzetto. Centrifugare nuovamente a 400 g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Posizionare la piastra sul ghiaccio, rimuovere il tampone FACS precedentemente aggiunto e risospendere le cellule in 200 microlitri di tampone FACS per pozzetto. Procedere immediatamente all'analisi da parte del FACS per acquisire 20.000 eventi nel cancello della cella viva.