Un rilevamento basato su array di peptidi di alloanticorpi HLA anti-donatore nei riceventi di organi

Prendi un array di peptidi derivato dall'antigene leucocitario umano di un donatore di organi o da una sequenza HLA comprendente diversi peptidi sulla membrana di cellulosa.

Ogni peptide porta almeno una discrepanza di aminoacidi tra la sequenza HLA del donatore e quella del ricevente, rappresentando un potenziale epitopo per il rigetto d'organo mediato da anticorpi.

Trattare con un tampone bloccante per prevenire l'interazione anticorpale non specifica.

Aggiungere il siero ricevente raccolto dopo il trapianto d'organo, contenente alloanticorpi.

Questi anticorpi, formati contro l'HLA del donatore, si legano al loro epitopo bersaglio.

Aggiungere un anticorpo secondario coniugato con perossidasi che si lega all'alloanticorpo.

Aggiungere il substrato chemiluminescente e il perossido di idrogeno. La perossidasi utilizza il perossido di idrogeno per ossidare il substrato, emettendo luce.

Scansiona la membrana per ottenere un'immagine.

Aggiungere un tampone per rimuovere gli anticorpi legati. Riprobe con il siero del ricevente pre-trapianto e ottieni un'immagine.

Rispetto all'immagine pre-trapianto, le macchie scure sull'immagine post-trapianto indicano epitopi HLA specifici del donatore che incitano alla reattività degli alloanticorpi.

Quando gli array sono stati sintetizzati, bloccare le membrane con 20 millilitri di latte scremato al 5% disciolto in soluzione salina tamponata Tris con Tween 20 allo 0,1% o TBST per il periodo di incubazione appropriato con oscillazione. Successivamente, lavare la membrana tre volte con 20 millilitri di TBST fresco per 5 minuti per lavaggio, seguita dall'incubazione con 20 microlitri di siero grezzo ricevente in latte al 2,5% in TBST per 2 o 3 ore a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, lavare la membrana tre volte per 10 minuti per lavaggio e incubare le membrane con l'anticorpo secondario IgG coniugato con perossidasi di rafano umano di capra per due ore.

Rimuovere l'anticorpo secondario non legato con tre lavaggi di 10 minuti in TBST e sviluppare le membrane in 5 millilitri di soluzione di luminol appena preparata più 5 millilitri di soluzione di perossido. Dopo un minuto, visualizzare i segnali di chemiluminescenza potenziati su un imager adatto.

Dopo aver salvato le immagini sviluppate, incubare le membrane con 20 millilitri di tampone di stripping commerciale a 37 gradi Celsius per 20 minuti, seguito da tre lavaggi di 10 minuti in TBST. Quindi bloccare, risondare e visualizzare le membrane come appena dimostrato con un campione di siero dello stesso paziente ottenuto in un momento diverso.