Valutazione della distribuzione intracellulare dei coniugati di anticorpi modificati con peptidi derivati da virus

Inizia con le cellule di eritroblasto umano aderenti.

Introdurre coniugati anticorpali modificati con peptidi derivati da virus. Questi coniugati contengono una sequenza di localizzazione nucleare, o NLS, dal virus e un residuo di acido colico.

Durante l'incubazione, i coniugati anticorpali interagiscono con i recettori della superficie cellulare e internalizzano all'interno degli endosomi.

L'acido colico nel coniugato aiuta a fuoriuscire dal compartimento endosomiale, consentendo l'accumulo intracellulare, mentre le proteine di trasporto e l'NLS facilitano la loro localizzazione nucleare.

Introdurre la tripsina e il tampone contenente EDTA per staccare le cellule e rimuovere i coniugati legati alla superficie.

Aggiungere terreni arricchiti con siero per inibire l'attività della tripsina.

Centrifuga per raccogliere le cellule, fissarle e permeabilizzarle.

Introdurre anticorpi secondari marcati con fluoroforo rosso lontano, legandosi a coniugati localizzati e wash.

Trattare con un colorante colorante nucleare.

Osserva al microscopio confocale e acquisisci immagini a varie profondità planari.

Dopo l'elaborazione dell'immagine, la cellula mostra piccoli focolai fluorescenti verdi all'interno del citoplasma e del nucleo, confermando la distribuzione intracellulare dei coniugati anticorpali.

Trattare le cellule bersaglio TF-1a con 200 nanomolari di coniugato acido 7G3-colico-anticorpo. Includere cellule trattate con anticorpi monoclonali di controllo modificati. Incubare 5 x 10⁶ cellule antigene-positive con i coniugati a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi rimuovere il surnatante e utilizzare un millilitro di PBS ghiacciato per lavare le cellule tre volte.

Aggiungere un terreno fresco e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un'altra ora. Successivamente, aggiungere 0,5 millilitri di PBS contenente lo 0,25% di tripsina e EDTA e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per un massimo di 30 minuti. Quindi, utilizzare 1,5 millilitri di terreno RPMI-1640 con il 10% di FBS per neutralizzare la tripsina.

Centrifugare le celle a 500 volte g per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e utilizzare 0,5 millilitri di PBS ghiacciato per lavare nuovamente le cellule tre volte. Aggiungi 0,5 millilitri di PFA all'1% e saccarosio all'1% in PBS alle cellule e mettile sul ghiaccio per 30 minuti per fissarle.

Quindi utilizzare 0,5 millilitri di PBS ghiacciato per lavare le celle tre volte e centrifugare i campioni a 250 volte g per cinque minuti. Quindi, aggiungere lo 0,15% di Triton X-100 in PBS alle cellule e permeabilizzarle sul ghiaccio per cinque minuti. Quindi con PBS ghiacciato, lavare le cellule e ripetere la centrifugazione.

Sospendere le cellule in 0,1 millilitri di PBS contenente due microgrammi per millilitro di un anticorpo policlonale secondario anti-Fc murino coniugato ad AlexaFluor 647 e incubare i campioni al buio a temperatura ambiente per un'ora. Centrifugare le cellule a 250 volte g per cinque minuti e utilizzare 0,5 millilitri di PBS ghiacciato per lavare le cellule tre volte.

Quindi risospendere le cellule in 0,5 millilitri di PBS. Aggiungere 10 microgrammi per millilitro di ioduro di propidio alle cellule. Quindi, utilizzare il mezzo di montaggio per montare 1 x 10⁵ cellule su vetrini prima di coprire il campione con un vetrino coprioggetti. Esaminare le cellule con un obiettivo a immersione in olio Plan Apo 60X, apertura numerica 1,42, su un microscopio confocale a scansione laser invertita.

Rileva la fluorescenza PI utilizzando il laser ad argon a 488 nanometri e il prisma a scansione spettrale impostato da 600 a 650 nanometri. Per la fluorescenza AF 647, utilizzare il laser elio-neon a 633 nanometri e il prisma a scansione spettrale impostato da 650 a 700 nanometri. Raccogli immagini da P1 e AF 647 in sequenza, 1024 x 1024 pixel con una media delle linee 2X scattata a intervalli di 0,5 micron attraverso l'intero spessore della cella. Presenta le immagini come proiezioni Z.

Per analizzare le cellule, valutare e registrare se la fluorescenza intracellulare nel citoplasma è raggruppata e vicina alla superficie cellulare o diffusa e omogenea. Inoltre, valutare l'intensità relativa della fluorescenza per cellula.