Laser Microdissezione Cattura di tessuti di mammiferi

Ciao, mi chiamo Rob Edwards. Sono il direttore della struttura di microscopia a cattura laser dell'Università della California di Irvine. Vi illustrerò l'utilizzo del microscopio a cattura laser che abbiamo qui.

Il nostro strumento è un Leica A-S-L-M-D, acquistato circa tre anni fa. Esistono due tipi diversi di sistemi di cattura laser. Uno può essere paragonato a un saldatore a punti, in cui un frammento di tessuto su un vetrino è posto sopra una membrana di plastica, che ricopre il tessuto.

Si utilizza quindi una sorgente laser per fondere la membrana, saldando in pratica il tessuto sulla membrana; successivamente la membrana viene rimossa, portando con sé il tessuto catturato. Per iniziare, per attivare il sistema di LCM, accendiamo in sequenza diversi strumenti. Cominceremo con il box di controllo A-S-L-M-D, che viene acceso qui.

Quindi accendiamo il computer, il che è abbastanza semplice. Se si dispone di un campione che richiede un'ottica a fluorescenza per identificare le cellule da catturare, si accenderebbe la lampada a mercurio per l'illuminazione in fluorescenza. Tuttavia, non utilizzeremo tale modalità per questa dimostrazione.

Se si desidera acquisire immagini di alta qualità dei campioni prima e dopo, si può accendere separatamente la telecamera spot proprio qui, dopo aver acceso il box logico e il computer; successivamente si accende l'unità di controllo della potenza del laser, che viene effettivamente attivata tramite una chiave situata qui dietro, nella parte inferiore dello strumento. Infine, si accende il monitor del computer. Sullo schermo sono presenti diverse impostazioni che sarà necessario conoscere.

Li userai piuttosto frequentemente. Si tratta di un programma classico basato su Microsoft Windows e, di conseguenza, esamineremo diverse voci di menu. Ma prima permettimi di parlare del desktop qui presente.

È presente una finestra in tempo reale che mostra ciò che il microscopio sta effettivamente visualizzando. Nella barra dei menu qui in alto, è possibile vedere un pulsante per le immagini in tempo reale e un pulsante di congelamento che può essere attivato e disattivato, per poi utilizzare il menu file e acquisire immagini fisse di una porzione di tessuto, ad esempio prima e dopo l'acquisizione, al fine di documentare il tessuto isolato. Il microscopio può funzionare in modalità campo chiaro o in modalità fluorescenza, a seconda che si stia acquisendo un tessuto colorato con ematina come controcolorazione o un tessuto colorato con fluorocromi.

I prossimi due pulsanti includono la modalità campione, che mette a fuoco il piano del palchetto del microscopio, e poi c'è la modalità collezionista che sposta il vetrino e consente di visualizzare il tessuto raccolto nella parte superiore del tubo di raccolta. Questa è una configurazione di tipo controllo qualità. Nella barra del menu seguono diversi strumenti di disegno, che verranno utilizzati per identificare le porzioni di tessuto o le cellule che si desidera acquisire.

Poi lungo il lato destro dello schermo sono presenti alcuni strumenti aggiuntivi per il disegno e l'acquisizione, tra cui alcune opzioni per le forme di disegno, alcune opzioni di taglio e quindi i pulsanti di controllo del taglio. Sulla piastra di controllo qui in basso si trova anche il dispositivo di raccolta, ovvero la parte del microscopio al di sotto del piano portaoggetti, che contiene i tubi einor nei quali viene raccolto il tessuto. I quattro pulsanti contrassegnati con A, B, C e D controllano quale tubo deve essere posizionato direttamente sotto il campione da acquisire.

Questo è un esempio di un tessuto tipico in sezione congelata che è stato preparato per la microdissezione con laser. Queste sono sezioni coronali della testa di un embrione di topo che sono state raccolte su un vetrino con pellicola metallica. Si trattava di sezioni congelate di otto micron che sono state successivamente essiccate e contrastate con ematina e conservate a meno 80 gradi Celsius fino all'uso.

Per montare questi vetrini sul microscopio, il microscopio è fornito di un supporto speciale e bisogna ricordare che il tessuto verrà raccolto in un tubo einor posizionato al di sotto del piano della piastra. Pertanto, il tessuto si trova su questo lato del vetrino ed effettivamente verrà montato nel portavetrini con il lato del tessuto rivolto verso il basso, in questo modo.

Il vetrino si inserisce in quel punto ed è trattenuto da una pressione a molla. E poi questo intatto, questo foro. Il portavetrino viene posizionato sul tavolino del microscopio tra queste due guide.

Si noterà che esiste un piccolo intaglio che si inserisce sotto una clip nella parte posteriore del portacampioni, tenendo il campione in posizione. E quando viene inserito, si avverte un chiaro scatto. Bene, la fase successiva da impostare è costituita dai tubi einor, che effettivamente cattureranno il tessuto.

È possibile utilizzare provette einor da 0,2 o 0,5 millilitri; queste si inseriscono in questi piccoli supporti, che a loro volta si adattano in questo vassoio, da posizionare in uno slot speciale sotto il palchetto. Il tessuto verrà quindi effettivamente raccolto all'interno della parte superiore del tappo della provetta einor. Per scopi illustrativi, qui sto utilizzando una provetta da 0,5 millilitri.

Quindi il cappuccio va inserito in questo modo, facendolo scivolare sotto attraverso l'apertura, e poi i bordi del cappuccio vengono trattenuti da quei dentini, e successivamente il cappuccio si aggancia sotto in questo modo; quindi l'intero cappuccio va inserito nel supporto. Ora, se si stanno isolando acidi nucleici, in particolare per l'estrazione di RNA, è possibile mettere una goccia di soluzione triolo di diverse centinaia di microlitri direttamente nel cappuccio. È importante non versare questo liquido nell'apparecchiatura, ovviamente, a causa della presenza di fenolo e di altri composti caustici nel reagente triolo.

Questo è il controllore del microscopio, come già affermato in precedenza; le ottiche, l'illuminazione e la messa a fuoco sono completamente motorizzate su questo strumento. Pertanto, la manopola di messa a fuoco si trova qui in alto. La manopola di controllo della traslazione lungo l'asse Y del palchetto è questa.

Il controllo della traslazione X è qui. In basso a sinistra si trova il controllo dell'iride, che regola l'illuminazione; il microscopio ricorda il livello di illuminazione impostato per ogni ingrandimento. Pertanto, quando si passa da un obiettivo all'altro, l'illuminazione viene regolata automaticamente.

Infine, sul lato destro del controller si trova il comando della torretta degli obiettivi, che permette di passare da un obiettivo all'altro. Questo strumento è dotato di cinque obiettivi: uno da 4x, uno da 10x, uno da 20x, uno da 40x e uno da 63x. Il primo passo per acquisire effettivamente un tessuto consiste nell'allineare il microscopio in modo che ciò che si vede sullo schermo corrisponda esattamente a ciò che verrà acquisito, al fine di allineare correttamente il microscopio.

Passiamo all'opzione del menu laser e selezioniamo calibra, quindi accettiamo e premiamo continua. Ora sono impostato su quattro x e si può notare un'area relativamente ampia di membrana qui. Si noti che non è presente tessuto.

Eseguiamo l'allineamento su un angolo del vetrino. Il laser ha inciso una crocetta nell'angolo in alto a destra dello schermo e utilizzerò il mouse per centrare il cursore su quella crocetta, quindi farò clic; il computer inciderà un'altra crocetta. Mi allineerò a quest'ultima e farò clic, dopodiché verrà incisa una terza crocetta a cui ci allineeremo.

La calibrazione per l'obiettivo 4x è ora completata per il microscopio, che è ora allineato e pronto per acquisire effettivamente il tessuto. Potrebbe aver notato durante il processo di allineamento che le linee incrociate che venivano tagliate erano piuttosto spesse. Questo è in realtà dovuto al fatto che la potenza di controllo del laser era impostata su un valore molto elevato.

Probabilmente non abbiamo bisogno di un tale grado di potenza di taglio. Illustrerò quindi come regolare la potenza del laser effettuando il taglio di una linea. Se disegno a mano libera una linea diagonale sullo schermo, seleziono un cappuccio e poi premo il pulsante di avvio del taglio, il computer eseguirà il taglio lungo la linea che ho definito.

E puoi vedere quanto è larga quella linea. Devo ridurre la potenza del laser. Fallo dunque.

Vado al menu del laser, entro in controllo e noterai che l'intensità è stata portata al massimo. Ridurrò l'intensità del laser a circa il 30% e accetterò questa impostazione. Ora, se traccio una nuova linea e la taglio, noterai che la larghezza del tessuto bruciato o della membrana bruciata è notevolmente inferiore.

E quindi, come principio generale, si desidera impostare la potenza di controllo del laser sul valore più basso possibile per minimizzare la quantità di tessuto che viene vaporizzata. Ora dimostrerò l'effettivo prelievo di un campione di tessuto utilizzando questo occhio speculare. Sono attualmente in campo con l'obiettivo microscopico e tenterò di acquisire una porzione relativamente ampia di tessuto.

Isoleremo l'intera lente dal centro di questo occhio. Per fare ciò, eseguirò un taglio a mano libera. Utilizzando il controllo di disegno nella parte superiore dello schermo, effettuerò il taglio.

Traccerò una linea intorno al campione da acquisire. Sto lavorando con un ingrandimento molto basso. Se si desiderano sezioni più precise o aree di tessuto più piccole, è ovviamente possibile acquisire a un ingrandimento maggiore.

Ho quindi selezionato l'area da tagliare e ora andrò nel menu disegna forme; di solito mantengo attiva l'opzione linee chiuse. L'opzione linee chiuse fa sì che, se si disegna una forma irregolare attorno a un oggetto senza racchiuderlo completamente, venga tracciata automaticamente una linea retta tra le estremità aperte della forma. Una volta identificata l'area da tagliare, inizieremo il processo di taglio e vedrete che il box di controllo focalizza il laser attraverso le aree, tagliando quasi completamente.

Spesso si verifica un "Chad sospeso" durante l'acquisizione di ampi frammenti di tessuto. In questo caso non si ottiene una completa separazione del tessuto. La prima cosa da provare è quindi tagliarlo nuovamente, e il laser seguirà il contorno del tessuto.

A volte, in alternativa, proprio dove è appeso, puoi disegnare un piccolo spazio e tagliare in quel punto, facendolo cadere. In questo modo abbiamo ora isolato questa porzione di tessuto. Come menzionato in precedenza, possiamo passare alla modalità di raccolta e verificare che questo frammento di tessuto si trovi effettivamente nel collettore o nel tappo del tubo einor.

Quindi verrò qui al nostro pulsante di controllo del collettore, lo premerò e vedrete che il microscopio cambierà ora la visualizzazione. Ora stiamo osservando la superficie interna del tubo einor e nella parte in basso a destra dello schermo c'è il frammento di tessuto catturato; effettuando la messa a fuoco è possibile vedere le singole cellule. Abbiamo quindi verificato di aver effettivamente catturato il tessuto selezionato.

Ora, il processo di cattura non avviene con un'efficienza del cento per cento perché questi tessuti che vengono catturati sono essenzialmente simili a foglie in caduta. Una certa piccola percentuale di frammenti di tessuto catturati non cadrà all'interno del coperchio del tubo einor, ma la percentuale di perdita è molto bassa una volta completata la cattura del tessuto desiderato. Il passaggio successivo, ovviamente, è rimuovere il tubo einor con il tessuto catturato dallo strumento e chiuderlo in modo sicuro.

E per fare ciò, estraiamo molto delicatamente dritto dal supporto in questo modo. Tenendo presente che il tappo del tubo deve rimanere rivolto verso l'alto, rimuovere il supporto dal vassoio e quindi estrarre con molta delicatezza il tubo. Far scivolare in questo modo, uscire dal supporto e poi spostare l'einor, non il coperchio, così.

Ora, se si è già depositata una goccia di triolo nel coperchio, il tessuto inizierà già il processo di solubilizzazione e si potrà tornare in laboratorio per completare l'isolamento dell'RNA. Esistono diversi produttori che commercializzano kit per l'isolamento dell'RNA su scala microscopica, come Amon, che è il produttore da noi preferito. E questo è tutto ciò che occorre fare.

Oggi vi ho illustrato la struttura del microscopio a cattura laser presso l'Università della California, Irvine. Abbiamo mostrato come si effettua la cattura di sezioni congelate di tessuto da vetrini rivestiti con foglio di alluminio, in preparazione all'isolamento dell'RNA da tale tessuto. Grazie per la vostra attenzione e buona fortuna con la vostra personale microdissezione a cattura laser.