Un metodo di immunocolorazione multiplex che utilizza anticorpi primari della stessa specie ospite

Prendi una sezione surrenalica fissa e permeabilizzata che comprende una corteccia e un midollo. Trattarlo con un tampone acido bollente, rompendo i legami incrociati indotti dalla fissazione per lo smascheramento dell'antigene.

Bloccare i siti di legame non specifici e introdurre anticorpi primari che si legano ai marcatori specifici della corteccia.

Aggiungere anticorpi secondari biotinilati che prendono di mira gli anticorpi primari e perossidasi coniugate con streptavidina che si legano alla biotina.

Introdurre una tiramide marcata con fluoroforo e perossido di idrogeno.

Le perossidasi immobilizzate utilizzano il perossido di idrogeno per attivare la tirammide, che si lega alle proteine vicine, marcando la corteccia.

Quindi, trattare la sezione con il tampone bollente per rimuovere gli anticorpi legati.

Introdurre gli stessi anticorpi primari generati dalla specie ospite che hanno come bersaglio i marcatori specifici del midollo e gli anticorpi secondari biotinilati.

Introdurre perossidasi coniugate con streptavidina e una diversa tiramide coniugata con fluorofori per marcare il midollo.

La rimozione degli anticorpi primari specifici della corteccia inibisce l'anticorpo secondario reintrodotto che li lega, prevenendo la cross-reattività.

Applicare un colorante nucleare ed eseguire l'imaging per visualizzare la corteccia e il midollo distintamente colorati, confermando l'assenza di cross-reattività anticorpale.

Prima della colorazione, decerare e reidratare i vetrini fissati in formalina e inclusi in paraffina con immersioni di cinque minuti in ciascuna soluzione come indicato. Dopo la seconda immersione in acqua distillata, posizionare i vetrini in 275 millilitri di soluzione bollente di citrato di sodio sul fondo di una scatola di puntali per pipette con coperchio e posizionare la scatola in un forno a microonde da 700 watt al 70% di potenza per otto minuti.

Al termine del trattamento, aprire il coperchio e lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente prima di lavare i vetrini con tre lavaggi di cinque minuti di PBST fresco in un barattolo Coplin. Per bloccare eventuali siti di legame aspecifici, dopo l'ultimo lavaggio, agitare il PBST in eccesso da ciascun vetrino e coprire i vetrini con un volume sufficiente di una soluzione bloccante appropriata.

Dopo 30 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata, agitare la soluzione bloccante in eccesso da ciascun vetrino e aggiungere 250 microlitri del primo anticorpo primario di interesse a ciascun campione. Per evitare che i campioni si secchino, i vetrini possono essere coperti da un pezzo di pellicola di paraffina.

Dopo un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius nella camera umidificata, lavare i vetrini tre volte con PBST fresco per cinque minuti per lavaggio. Scrollarsi di dosso il PBST in eccesso, quindi coprire rapidamente ogni vetrino con 250 microlitri di una soluzione di anticorpi secondari appropriata per un'incubazione di un'ora nella camera umidificata a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini tre volte in PBST fresco come dimostrato e aggiungere 250 microlitri di streptavidina perossidasi di rafano appena preparata a ciascun vetrino. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente, lavare i vetrini tre volte in PBST fresco, quindi scrollarsi di dosso il PBST in eccesso e coprire ogni vetrino con 250 microlitri di soluzione di fluoroforo tiramide appena preparata.

Un minuto dopo, immergere i vetrini in PBST fresco, seguito da tre lavaggi di due minuti in PBST fresco. Dopo l'ultimo lavaggio, applicare alcune gocce di una soluzione 1 a 1 di glicerolo in PBS sulle sezioni e verificare la presenza di un segnale fluorescente mediante microscopia a fluorescenza.

Per rimuovere il primo complesso anticorpale, posizionare i vetrini marcati con anticorpi in 275 millilitri di soluzione bollente di citrato di sodio per almeno otto minuti, come dimostrato. Al termine del trattamento, aprire il coperchio e lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente, prima di lavare i vetrini tre volte con PBST per cinque minuti per lavaggio.

Per colorare la seconda proteina bersaglio di interesse, dopo aver dimostrato il blocco per il legame aspecifico, etichettare ogni campione con 250 microlitri del secondo anticorpo primario di interesse a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina successiva, lavare i vetrini tre volte per cinque minuti in PBST fresco per lavaggio prima di coprire ogni vetrino con 250 microlitri di una soluzione di anticorpi secondari appropriata per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, lavare i vetrini tre volte in PBST fresco come dimostrato e aggiungere 250 microlitri di streptavidina perossidasi di rafano appena preparata a ciascun vetrino. Per sviluppare il segnale per la seconda proteina bersaglio di interesse dopo tre lavaggi PBST, trattare i vetrini con una tiramide coniugata con fluorofori in un diverso spettro fluorescente.

Per fermare lo sviluppo del segnale della tiramide, immergere i vetrini in PBST, quindi colorare i campioni con un colorante nucleare appropriato.