Analisi morfologica del Drosophila Larvale dendriti sensoriali e periferico Neuron assoni utilizzo Mosaici genetici

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare la morfologia dettagliata dei neuroni di drosophila, larvale, dendritica, arborizzazione. Ciò si ottiene raccogliendo prima gli embrioni, invecchiandoli e generando cloni genetici marcati con GFP mediante l'espressione della lipasi indotta da shock termico. Il secondo passo consiste nel selezionare le larve con cloni di neuroni fluorescenti e scattare un'immagine dei loro ABA dendritici.

Dopo l'imaging della lava, vengono sezionati, fissati e colorati immunologicamente in modo che possano essere montati e i loro porti dendritici e le morfologie terminali assonali possano essere visualizzati attraverso la microscopia a immunofluorescenza confocale. Oggi dimostrerò un protocollo per l'analisi morfologica degli OID e degli esoni dei sensori periferici inferiori di sula utilizzando mos genetici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo neurologico, come ad esempio quali sono i programmi genetici che controllano l'identità neurale, la forma orale dendritica e il cablaggio esterno?

Inizia questo protocollo raccogliendo gli embrioni su piatti di succo di mela. Lo shock termico viene erogato in un bagno d'acqua a 38 gradi Celsius e la durata varia in base alla genetica dell'embrione e alle dimensioni desiderate del clone. Per questo protocollo, generare cloni di markum da embrioni con un driver di neuroni di arborizzazione pand dendritica Prima dello shock termico, mantenere gli embrioni marker a 25 gradi Celsius, circondati da umidità e tessuti per due ore.

Preparare le piastre di raccolta per lo shock termico rendendole sommergibili utilizzando piastre vuote e para fill. Quindi lo shock termico degli embrioni marcatore per un'ora per generare piccoli cloni o marcatura di singoli neuroni. Per aumentare il numero di cloni, utilizzare uno shock termico prolungato incubando per 45 minuti nel bagno, seguito da 30 minuti a temperatura ambiente e quindi altri 30 minuti nel bagno.

Per generare cloni flipout, raccogliere gli embrioni per 24 ore continue. Questo protocollo utilizza un driver specifico di classe quattro. Shock termico gli embrioni flipout per un'ora dopo lo shock termico.

Posizionare le piastre di raccolta in una capsula di Petri di 10 centimetri circondata da umido, tessuti e coltura. Gli embrioni sono a 25 gradi Celsius durante il monitoraggio della coltura degli embrioni e reintegrano la pasta di lievito secondo necessità. Perché la nutrizione influisce in modo critico sullo sviluppo neuronale.

Mantenere la coltura fino a quando il terzo vagante nella lava stellata può essere raccolto brevemente e sciacquare delicatamente le larve del terzo stadio in acqua di rubinetto e trasferirle su una piastra di agar. Ora esamina le larve usando un potente microscopio da dissezione a fluorescenza e una pinza per insetti. Identificare le larve con neuroni positivi alla GFP nella parete corporea e trasferirle su un vetrino di depressione con una goccia di glicerolo all'80%.

Posizionare un vetrino coprioggetti sullo scivolo per immobilizzare la lava. Assicurarsi che non rimanga aria tra la lava e il vetrino coprioggetti. Utilizzare la microscopia confocale standard per visualizzare i neuroni di interesse attraverso la cuticola di lava.

Per cambiare la posizione della lava per migliorare l'angolo di visione, premere delicatamente il vetrino coprioggetti per far rotolare la lava. Inizia questo protocollo trasferendo una lava sulla piastra di protezione SIL usando una pinza per insetti. Quindi fissarlo alle estremità anteriore e posteriore.

Quindi aggiungere il tampone HL 3.1 senza calcio. Ora tagliate a metà strada attraverso entrambe le estremità della lava perpendicolarmente all'asse anteriore posteriore. Quindi tagliare lungo la linea mediana tra le due trachee.

Tagliare con cura ogni singola connessione tracheale alla parete corporea prima di rimuovere delicatamente l'intestino. Ciò mantiene intatti i nervi segmentali che corrono tra il SNP e il SNC. Con la larva ancora fissata alla piastra di protezione della cella, fissarla in 4% di para formaldeide in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente su uno shaker leggermente rotante, eseguire ogni dissezione in meno di cinque minuti.

In caso contrario, le niti dei neuroni di autorizzazione dendritica inizieranno a degradarsi. Dopo la fissazione, rimuovere i tessuti larvali in eccesso. Quindi lavare i filetti tre volte con PBST per 10 minuti per lavaggio.

Dopo i lavaggi, incubare le larve per 20 minuti a temperatura ambiente in soluzione bloccante agitando delicatamente. Al termine del blocco, sostituire la soluzione bloccante con la soluzione di anticorpi primari. Posizionare il campione in un piccolo contenitore di plastica circondato da umido e fazzoletti e incubarlo per una notte a quattro gradi Celsius Il giorno successivo, continuare l'incubazione per un'altra ora a temperatura ambiente.

Quindi lavare il filetto di lava sei volte in PBST per 10 minuti per lavaggio. Ora aggiungi l'anticorpo secondario e metti i filetti in un contenitore scuro per evitare il fotosbiancamento del Fluor. Incubare i filetti per ore a temperatura ambiente o per una notte a quattro gradi Celsius, seguiti da un'ora a temperatura ambiente.

Infine lavare i filetti sei volte in PBST per 10 minuti per lavaggio. I tessuti sono quindi pronti per essere montati. Per visualizzare i terminali degli assoni, è sufficiente montare la cuticola del filetto larvale con il lato rivolto verso il basso in glicerolo all'80% in un vetrino a depressione.

Per creare immagini più chiare dei dendriti, creare una montatura permanente con vetrini coprioggetti rivestiti in PLL. Per codificare i vetrini coprioggetto e l'aliquota del PLL. Portare fino a 10 millilitri di acqua distillata doppia e aggiungere 20 microlitri di flusso fotografico Kodak.

Immergere i vetrini coprioggetti per 30 minuti nella soluzione PLL e asciugarli all'aria dopo la rimozione. Quindi sciacquarli brevemente con acqua e aria. Asciugateli di nuovo.

Ripeti questo processo due volte. A partire dal bagno PLL, i vetrini trattati dureranno circa un mese. Ora monta un muscolo del filetto larvale sezionato con il lato rivolto verso il basso in una goccia di PBS su un vetrino coprioggetti PLL.

Il filetto aderirà rapidamente al vetrino coprioggetto utilizzando un pezzo di carta velina. Rimuovere quanto più liquido possibile, tuttavia, non lasciarlo asciugare completamente. Successivamente disidratare i filetti larvali e una serie di bagni di etanolo di 10 minuti, iniziando con il 35% di etanolo, seguito dal 50% poi dal 70% al 95% e infine dal 100% e infine da un secondo bagno di etanolo al 100%.

Seguire i bagni di etanolo con due o tre bagni di 10 minuti in xilene. Quindi mettere una goccia di DPX su un vetrino pulito e posizionare con cura il vetrino coprioggetti nel DPX, riempindolo con il lato rivolto verso il basso. Tieni il vetrino al buio e attendi un giorno che il DPX si solidifichi.

Prima di eseguire l'imaging del tessuto utilizzando la microscopia in vivo e focale, è possibile acquisire immagini come questa. L'intero pergolato di un neurone di arborizzazione dendritica di classe quattro. Questo è un primo piano di un pergolato dendritico di un neurone di classe tre marcato IHC che è stato fissato correttamente per preservare la morfologia.

Il riquadro mostra la degradazione che può verificarsi dopo una dissezione e una fissazione non riuscite. Questa sovrapposizione mostra un singolo terminale assonale di classe quattro nel SNC. L'assone è etichettato con anti GFP in verde e tutte le termiti di classe quattro a sono colorate con anti CD due in magenta.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di sezionare e fissare rapidamente i campioni tracciando gli assoni dalla periferia al SNC. È utile tenere presente che i neuroni PNS in ogni corpo si proietteranno nel segmento cognitivo del codice del nervo di sfiato. Inoltre, se si desidera visualizzare solo i dendriti, rimuovere i CNA durante la dissezione e la colorazione può essere eseguita in aggiunta ai tubi anziché sulle piastre.

Quando si montano questi filetti per l'imaging dei dendriti, tagliare prima la testa con i ganci della bocca e la parte posteriore con scintillii. Per una preparazione di piacere.