Analisi morfologica del Drosophila Larvale dendriti sensoriali e periferico Neuron assoni utilizzo Mosaici genetici

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare la morfologia dettagliata dei neuroni larvali di arborizzazione dendritica di drosophila. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo embrioni, invecchiandoli e generando cloni genetici marcati con GFP mediante espressione indotta da shock termico della lipasi. Il secondo passaggio consiste nella selezione di larve con cloni neuronali fluorescenti e nell'acquisizione di un'immagine delle loro ABA dendritiche.

Dopo l'acquisizione delle immagini della larva, queste vengono dissezionate, fissate e sottoposte a immunomarcatura in modo da poterle montare e visualizzare, mediante microscopia confocale a immunofluorescenza, le morfologie dei loro alberi dendritici e dei terminali assonici. Oggi illustrerò un protocollo per l'analisi morfologica dei sensori periferici inferiori sula e degli esoni mediante mos genetici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dello sviluppo neuronale, come ad esempio quali programmi genetici controllano l'identità neuronale, la forma orale dendritica e le connessioni esterne?

Iniziare questo protocollo raccogliendo embrioni su piastre con succo di mela. Lo shock termico viene effettuato in un bagno d'acqua a 38 gradi Celsius, e la durata varia in base alla genetica degli embrioni e alle dimensioni desiderate delle linee cellulari. Per questo protocollo, generare linee cellulari markum da embrioni contenenti un promotore per neuroni di tipo pand che innerva l'arborizzazione dendritica. Prima dello shock termico, mantenere gli embrioni marcatori a 25 gradi Celsius, circondati da tessuti umidi, per due ore.

Preparare le piastre di raccolta per lo shock termico rendendole immergibili mediante l'uso di piastre vuote e parafin. Quindi sottoporre gli embrioni marcatori a shock termico per un'ora per generare cloni piccoli o l'etichettatura di singoli neuroni. Per aumentare il numero di cloni, utilizzare uno shock termico prolungato incubando per 45 minuti nel bagno, seguiti da 30 minuti a temperatura ambiente e quindi altri 30 minuti nel bagno.

Per generare cloni flipout, raccogliere gli embrioni per 24 ore consecutive. Questo protocollo utilizza un attivatore specifico per la classe quattro. Sottoporre gli embrioni flipout a shock termico per un'ora dopo lo shock termico.

Posizionare le piastre di raccolta in una capsula di Petri da 10 centimetri circondata da tessuti umidi e coltura. Gli embrioni vengono monitorati a 25 gradi Celsius durante la coltivazione, e la pasta di lievito va reintegrata secondo necessità, poiché la nutrizione influisce in modo critico sullo sviluppo neuronale.

Mantenere la coltura fino a quando si possono raccogliere brevemente le larve di terzo stadio in movimento e risciacquare delicatamente le larve di terzo stadio con acqua del rubinetto, quindi trasferirle su una piastra di agar. Esaminare ora le larve utilizzando un microscopio stereoscopico a fluorescenza potente e pinzette per insetti. Identificare le larve con neuroni positivi per GFP nella parete corporea e trasferirle su un vetrino con una goccia di glicerolo al 80%.

Posizionare un coprioggetto sul vetrino per immobilizzare la larva. Assicurarsi che non rimanga aria tra la larva e il coprioggetto. Utilizzare una microscopia confocale standard per visualizzare i neuroni di interesse attraverso la cuticola della larva.

Per modificare la posizione della lava in modo da ottenere un angolo di osservazione migliore, spingere delicatamente il coprioggetto per far rotolare la lava. Iniziare questo protocollo trasferendo una lava sulla piastra di protezione SIL utilizzando pinzette da entomologia. Quindi fissarla agli estremi anteriore e posteriore.

Quindi aggiungere il tampone HL 3.1 privo di calcio. Ora effettuare un taglio parziale ad entrambe le estremità della larva, perpendicolarmente all'asse anteroposteriore. Successivamente, tagliare lungo la linea mediana tra le due trachee.

Tagliare con attenzione ogni singola connessione tra la trachea e la parete corporea prima di rimuovere delicatamente l'intestino. Questo permette di mantenere intatti i nervi segmentali che corrono tra il SNP e il SNC. Con la larva ancora fissata alla piastra di supporto, fissarla in paraformaldeide al 4% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente su un agitatore rotante delicato, eseguendo ogni dissezione in meno di cinque minuti.

Altrimenti, i neuriti dei neuroni autorizzativi dendritici inizieranno a degradarsi. Dopo la fissazione, rimuovere i tessuti larvali in eccesso. Quindi lavare i filetti tre volte con PBST per 10 minuti per ogni lavaggio.

Dopo i lavaggi, incubare le larve per 20 minuti a temperatura ambiente nella soluzione di blocco con agitazione delicata. Al termine del blocco, sostituire la soluzione di blocco con la soluzione dell'anticorpo primario. Posizionare il campione nel contenitore di plastica piccolo circondato da tessuti umidi e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, proseguire l'incubazione per un'ulteriore ora a temperatura ambiente.

Quindi lavare il filetto di lava sei volte in PBST per 10 minuti per ogni lavaggio. Aggiungere ora l'anticorpo secondario e collocare i filetti in un contenitore al buio per prevenire la fotodegradazione del Fluor. Incubare i filetti per alcune ore a temperatura ambiente oppure per tutta la notte a quattro gradi Celsius, seguito da un'ora a temperatura ambiente.

Infine, lavare i preparati sei volte in PBST per 10 minuti per ogni lavaggio. I tessuti sono ora pronti per essere montati. Per visualizzare i terminali assonali, montare semplicemente il preparato del larva con la cuticola rivolta verso il basso in glicerolo al 80% su un vetrino con cavità.

Per ottenere immagini più chiare delle dendriti, preparare un vetrino permanente con coprioggetti rivestiti con PLL. Per marcare i coprioggetti, aggiungere un'aliquote di PLL. Portare a 10 millilitri con acqua doppio distillata e aggiungere 20 microlitri di Kodak photo flow.

Immergere i coprioggetti per 30 minuti nella soluzione di PLL ed essiccarli all'aria dopo il prelievo. Risciacquarli brevemente con acqua ed essiccarli nuovamente.

Ripetere questo processo due volte. A partire dal bagno di PLL, le lamelle trattate rimangono stabili per circa un mese. Ora montare un muscolo a filetto larvale dissezionato, con la faccia muscolare rivolta verso il basso, in una goccia di PBS su una lamella di PLL.

Il filetto aderirà rapidamente al vetrino coprioggetto utilizzando un pezzo di carta da filtro. Rimuovere la maggior quantità possibile di liquido, tuttavia non permettere che si secchi completamente. Successivamente disidratare i filetti larvali con una serie di bagni di etanolo di 10 minuti ciascuno, iniziando con etanolo al 35%, seguito da 50%, poi 70%, poi 95%, poi 100% e infine un secondo bagno con etanolo al 100%.

Successivamente all'etanolo, eseguire due o tre bagni di 10 minuti in xilene. Poi mettere una goccia di DPX su un vetrino pulito e posizionare con attenzione il coverslip nel DPX, capovolgendolo. Lasciare il vetrino al buio e attendere un giorno affinché il DPX si solidifichi.

Prima di acquisire immagini del tessuto mediante microscopia in vivo e microscopia focale, è possibile catturare immagini come questa. L'intero albero dendritico di un neurone di arborizzazione dendritica di classe quattro. Questo è un ingrandimento di un albero dendritico proveniente da un neurone di classe tre marcato mediante IHC che è stato correttamente fissato per preservarne la morfologia.

L'ingrandimento mostra il degrado che può verificarsi dopo una dissezione e fissazione non riuscite. Questo sovrapposizione mostra un singolo assone di classe quattro nel SNC. L'assone è marcato con anti GFP in verde e tutti gli assoni di classe quattro sono controcolorati con anti CD2 in magenta.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di dissezionare e fissare rapidamente i campioni seguendo gli assoni dalla periferia verso il SNC. È utile tenere presente che i neuroni del SNP di ciascun segmento corporeo proiettano al segmento corrispondente del cordone nervoso ventrale. Inoltre, se si desidera visualizzare soltanto le dendriti, rimuovere i CNAs durante la dissezione e la colorazione può essere eseguita in provette invece che su piastre.

Quando si montano questi filetti per l'immagine delle dendriti, tagliare prima la testa con i ganci boccali e la parte posteriore con le scintillio. Per una preparazione ottimale.