Selezione di Plasmodium falciparum Parassiti per Cytoadhesion alle cellule cerebrali umane endoteliali

L'obiettivo generale di questa procedura è selezionare plasmodio, fpar e parassiti per il legame con cellule endoteliali cerebrali umane. Questo viene ottenuto innanzitutto incubando una coltura di plasmodio, fpar e parassiti, che contiene una miscela di globuli rossi infetti e non infetti, con uno strato di cellule endoteliali cerebrali umane; successivamente si procede a lavare via i globuli rossi non infetti e non legati, effettuando diversi lavaggi con il mezzo di coltura. Vengono quindi aggiunti globuli rossi freschi per consentire un'ulteriore crescita della popolazione parassitaria.

L'ultimo passaggio, alcune settimane dopo, consiste nel ripetere la selezione complessiva non appena viene raggiunta una parasitemia sufficiente. In definitiva, la microscopia viene utilizzata per mostrare un elevato numero di parassiti legati agli HBE five i. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della malaria cerebrale, come l'identificazione di ligandi parassitari o molecole recettrici dell'ospite coinvolte nel processo di citoadesione.

Preparare globuli rossi umani da sangue intero di gruppo O positivo separando i globuli rossi dai globuli bianchi mediante il passaggio attraverso un filtro di deplezione dei leucociti. Centrifugare le cellule a 1000 G per 10 minuti e risospendere il pellet in tutto il mezzo PMI incompleto.

Ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta, quindi risospendere il pellet. Nel nostro mezzo PMI incompleto al 50% di ematocrito, i globuli rossi vengono conservati a quattro gradi Celsius per una settimana. Coltivare i globuli rossi infettati da Odium Valspar.

Con mezzo completo RPMI al 2% di ematocrito, incubare a 37 gradi Celsius con 3% di anidride carbonica, 1% di ossigeno e 96% di azoto ogni giorno. Preparare uno striscio di sangue per valutare lo stadio di sviluppo dei parassiti. Cambiare il mezzo ogni giorno centrifugando la coltura a 500 ×g per cinque minuti.

Aspirare il soprannatante ed aggiungere fresco mezzo RPMI completo circa una volta alla settimana. Sincronizzare i parassiti mediante trattamento con sorbitolo acquoso al 5%. Il saggio di selezione può essere eseguito il giorno successivo a una coltura in stadio anellare in cui si osserva un minimo di 5%–10% di parassitemia.

In aggiunta, è necessaria una quantità di coltura parassitaria sufficiente a formare un volume cellulare parassitario di 30 microlitri per ogni piatto da 60 millimetri di cellule hbe five eye. Preparare un piatto da coltura tissutale da 60 millimetri per ricevere la linea cellulare di endotelio microvascolare del cervello umano o H back fivei aggiungendo due microgrammi per centimetro quadrato di fibronectina e soluzione salina sterile al piatto.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque-venti minuti, quindi aspirare la soluzione di fibronectina. Successivamente, raccogliere le cellule HBE five I da un flacone per colture tessutali da 25 centimetri quadrati mediante ionizzazione e centrifugazione Reese, sospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di DMEM, mezzo completo. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di questa sospensione cellulare alla piastra per colture tessutali trattata con fibronectina e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due-tre giorni, fino a quando la coltura raggiunge una confluenza del 50-100% e le colture di parassiti sono pronte per la citoaian nel giorno del saggio.

La coltura di HBE cinque I dovrebbe avere una confluenza compresa tra il 50 e il 100%. La coltura del parassita, invece, dovrebbe trovarsi nella fase di trofozoiti pigmentati, con una parassitemia di almeno dal 5 al 10% e un ematocrito del 2%. Per prima cosa, pipettare 1,5 millilitri di coltura del parassita dalla fiala di coltura e trasferirli in un tubo da centrifuga da 15 millilitri.

Centrifugare la coltura a 500 G per cinque minuti e ri-sospendere in 10 millilitri di DMEM incompleto, appena riscaldato. Ripetere questo passaggio di lavaggio una seconda volta al termine della centrifugazione finale.

Aspirare il DMEM incompleto, il mezzo, e ri-sospendere il pellet di 30 microlitri in 1,5 millilitri di DMEM incompleto, integrato con il 1% di BSA. Successivamente, recuperare la piastra da 60 millimetri di hvac.Five.

Le cellule oculari aspirano il terreno di coltura e vengono lavate due volte con tre millilitri di DMEM. Mezzo incompleto. Aggiungere la soluzione di parassiti, la piastra di HPE con cinque cellule oculari e incubare nell'incubatore per colture cellulari per un totale di 75 minuti.

Due volte durante l'incubazione, risospendere i parassiti agitando delicatamente e ruotando la piastra secondo l'incubazione. Lavare la piastra cinque volte aspirando il mezzo con una pipetta di plastica e aggiungendo tre millilitri di mezzo DMEM incompleto tiepido; dopo l’ultimo lavaggio, agitare dolcemente la piastra ed esaminarla al microscopio invertito. Se sono ancora visibili molte emazie non infette, ripetere la procedura di lavaggio come descritto sopra per rimuoverle.

Dopo aver aspirato il mezzo dalla piastra, risospendere 40 microlitri di volume cellulare concentrato di globuli rossi freschi in mezzo RPMI completo temperato e aggiungere la sospensione cellulare alla piastra. Posizionare la piastra in una camera di incubazione aerata. Quindi gassare la piastra con 3% di anidride carbonica, 1% di ossigeno e 96% di azoto per tre minuti.

E posizionare la camera in un incubatore a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Durante questa incubazione, i parassiti allo stadio schizogonico si rompono e i maiti reinvasano i globuli rossi. Il giorno successivo, raccogliere i parassiti allo stadio anellare mediante lavaggio.

Con mezzo RPMI incompleto, in modo analogo a quanto fatto in precedenza, ma con una pipettatura più energica del mezzo e oscillazione della piastra. Conservare tutto il mezzo utilizzato, che conterrà i globuli rossi risospesi, in un tubo conico da 15 millilitri. Esaminare la piastra al microscopio invertito per assicurarsi che tutti i globuli rossi siano stati rimossi dalla capsula prima della centrifugazione.

Il tubo contenente il mezzo della piastra lavata viene centrifugato per formare il pellet dei parassiti; scartare il sopranatante e risospendere in cinque millilitri di mezzo RPMI completo, quindi trasferire la sospensione in un fiasco da 25 centimetri quadrati per la coltivazione. I parassiti vengono coltivati per due-quattro settimane fino a ottenere una quantità sufficiente di materiale e poter eseguire un nuovo ciclo di selezione.

I parassiti HB tre non selezionati mostrano un basso livello di legame con le cellule endoteliali oculari hbe cinque. Questa immagine mostra le cellule endoteliali oculari hbe cinque fissate con glutaraldeide al 2% e colorate con Giemsa, osservate al microscopio con un ingrandimento di 1000 volte. Le immagini sono state acquisite dopo aver lavato via i globuli rossi non infetti e i globuli rossi infetti non legati. Dopo ogni ciclo di selezione, un numero sempre maggiore di parassiti si lega alle cellule endoteliali e i cicli di selezione possono essere ripetuti a intervalli di tempo più brevi dopo cinque round di selezione.

Si ottengono popolazioni di parassiti ad alto legame, come mostrato qui con i parassiti HB tre HBE. Questa tabella mostra un riepilogo dei ceppi di plasmodio alspar che sono stati selezionati con successo per il legame con HE cinque. Si osserva che HB tre è stato inoltre selezionato su HE cinque attivato da TNF dopo cinque cicli di selezione.

La ceppa DD due non ha mostrato alcun aumento del legame con HBE cinque I rispetto al DD due non selezionato. Questa immagine a 400 volte di ingrandimento mostra il legame dei parassiti plasmodium alspar HB tre con cellule endoteliali dermiche HD MEK prima della selezione. Qui viene mostrato il legame dei parassiti plasmodium alspar HB tre con la stessa linea cellulare endoteliale dermica dopo quattro cicli di selezione.

Questa figura mostra il legame dei parassiti Plasmodium spar HB3 con le cellule endoteliali polmonari HPME prima della selezione. Ora il legame dei parassiti Plasmodium spar HB3 con le cellule HPME è aumentato dopo quattro cicli di selezione. Sebbene il mezzo di coltura per HDE, C e HPEC differisca leggermente, il protocollo utilizzato per la selezione era identico a quello impiegato per HBE5I. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti metodi come RT-PCR o microanalisi per rispondere a ulteriori domande, ad esempio caratterizzare la trascrizione dell'antigene di superficie variabile nei parassiti non selezionati e in quelli selezionati.