Name: Selezione di Plasmodium falciparum Parassiti per Cytoadhesion alle cellule cerebrali umane endoteliali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Scopri un metodo per selezionare Plasmodium falciparum che si lega a cellule endoteliali cerebrali umane. Questo protocollo permette di studiare i meccanismi della malaria cerebrale e identificare potenziali bersagli terapeutici.

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Ringraziamo Francesco Candal, CDC Technology Transfer Office, Atlanta Georgia per HBEC-5i cellule. Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust (4 volte all&#39;anno borsa di studio di dottorato di AC e Senior Fellowship in Basic Scienze Biomediche alle JAR, concedere numero 084226).

Raccomandazioni generali Umano microvascolari cerebrali delle cellule endoteliali (HBEC-5i) la cultura è stato precedentemente descritto in 6, 8. P. parassiti falciparum sono stati coltivati ​​come in 9. Entrambi HBEC-5i e P. falciparum culture parassita deve essere conservato in condizioni sterili in ogni momento. Tutti i reagenti devono essere pre-riscaldato a 37 ° C. Si consiglia di controllare regolarmente la contaminazione da micoplasma 10 mediante PCR (Minevera Biolabs, le istruzioni del produttore successivo). Il protocollo è riassunto nella Figura 1. 1. Cellule endoteliali cultura di routine <ol><li> Preparare i reagenti necessari. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Medio per preparare </td><td> Reagenti </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> "Incompleto DMEM" </td><td> DMEM-F12 Ham </td><td> 500ml </td></tr><tr><td> &amp;nbsp; </td><td> L-glutammina 200mm </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> Penicillina / streptomicina 100X </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 1,3 ml (aggiustare il pH a 7,4) </td></tr><tr><td> "Completo DMEM" </td><td> "Incompleto DMEM" </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Siero fetale bovino inattivato al calore </td><td> 50ml </td></tr><tr><td></td><td> Supplemento di crescita delle cellule endoteliali </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Cultura HBEC-5i in una reflex 25 centimetri 2 pallone con media 10ml DMEM completo in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Celle di passaggio quando diventano confluenti. Rimuovere il supporto di vecchia aspirazione e lavare due volte con medium DMEM incompleti o tessuto della cultura di grado PBS (Ca 2 + e Mg 2 + libero) pre-riscaldato a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 1 ml di pre-riscaldato Provapsin-EDTA (0,025% tripsina, 0.5MM EDTA), agitare per coprire la totalità del pallone e incubare per circa 2 min a 37 ° C. </li><li> Controllare al microscopio invertito che almeno il 90% delle cellule sono stati staccati. In caso di necessità, bussare delicatamente la parte inferiore del pallone per staccare le cellule aderenti. Aggiungere 10 ml di medium DMEM completo di bloccare le cellule tripsina e trasferire in una provetta da 15 ml conica. Centrifugare per 4 min a 300 gr a temperatura ambiente (RT). </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet con 10 ml di medium DMEM completo. Pipettare la soluzione su e giù per risospendere completamente le cellule. </li><li> Aggiungere 1 o 2 ml di sospensione cellulare in un pallone nuova cultura e aggiungere 8 ml di terreno fresco per mantenere la cultura. Valutare la crescita della cultura ogni giorno sotto un microscopio rovesciato e il cambiamento di media ogni 2 o 3 giorni prima che diventa gialla. </li></ol> 2. Preparazione cellule endoteliali per una selezione <ol><li> Due giorni prima del giorno del Selectio n, aggiungere fibronectina diluito in PBS sterile (2 mg / cm 2) in uno (o più) 60 millimetri piatto di Petri. Incubare il piatto per 5 a 20 min a 37 ° C, quindi rimuovere la soluzione di fibronectina, che possono essere conservati a 4 ° C per un mese e riutilizzati una volta. </li><li> Celle di passaggio, come descritto nei paragrafi 1.3. a 1,5. Assumendo che le cellule del 100% confluenti sono state staccate e risospesi in media 10ml DMEM completo (sezione 1.6., Risospendere con un volume equivalente di media se la confluenza è inferiore, ad esempio, risospendere con 8ml se la confluenza è stata 80%), aggiungere 1,5 ml di sospensione cellule alla fibronectina piatto rivestito di Petri e un altro 1,5 ml di medium DMEM completo. </li><li> Porre la capsula Petri seminati in incubatrice. Nota: Idealmente, la confluenza sarà di circa il 90% al momento della selezione di due giorni dopo. </li><li> Opzionale. Per attivare HBEC-5i, aggiungere la (fattore di necrosi tumorale) citochina TNF ad una concentrazione finale di 50μg/ml 24 ore precedenti la selezione. </li></ol>e_title "&gt; 3. Plasmodium falciparum routine cultura <ol><li> Preparare i reagenti necessari (vedi tabella qui sotto). Preparare umano globuli rossi (RBC) separando sangue intero (gruppo O +) dal passaggio attraverso un filtro a esaurimento dei leucociti (vedere "Metodi di Ricerca in Malaria" pubblicazione 11 per la coltura generale parassiti della malaria). Lavare RBC due volte per centrifugazione a 400 g per 5 min e risospendere con 10 ml RPMI incompleta. Tenere RBC lavati a 4 ° C in media incompleta al 50% di ematocrito. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Medio per preparare </td><td> Reagenti </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> "Incompleto RPMI" </td><td> RPMI 1640 (con il bicarbonato) </td><td> 500ml </td></tr><tr><td></td><td> Hepes 1M </td><td> 12.5ml </td></tr><tr><td></td><td> Glucosio 20% </td><td> 5ml </td></tr><tr><td></td> L-glutammina 200mm <td> 5ml </td></tr><tr><td></td><td> Gentamicina 50mg/ml </td><td> 250μl </td></tr><tr><td></td><td> NaOH 1M </td><td> 0,7 ml (aggiustare il pH a 7,2) </td></tr><tr><td> "RPMI completo" </td><td> "Incompleto RPMI" </td><td> 450ml </td></tr><tr><td></td><td> Pool umano (non immune) nel siero </td><td> 50ml </td></tr></tbody></table> <ol start="2"><li> Cultura P. falciparum dei globuli rossi infetti con il mezzo RPMI completo al 2% di ematocrito ed incubare a 37 ° C con il 3% di CO 2, 1% O 2, e 96% N 2. Fai striscio Giemsa 11 al giorno per valutare lo stadio di sviluppo di parassiti (Figura 2). </li><li> Regolarmente (circa una volta alla settimana), sincronizzare la cultura da un trattamento sorbitolo 12. Il giorno prima il test di selezione, allo scopo di un anello allo stadio cultura parassitemia al 5% o più (idealmente almeno 10%). </li></ol> 4. Selezione di P. falciparum per cytoadhesion alle cellule endoteliali <ol><li> Il giorno del test, la cultura parassita dovrebbe essere in fase vegetativa pigmentate (Figura 2) (idealmente parassitemia 10%), mentre HBEC-5i cultura dovrebbe essere da 50 a 100% confluenza (idealmente 90%). 30μl di ematocrito di cultura parassita è necessaria per HBEC-5i piastra di Petri. </li><li> Lavare i parassiti due volte per centrifugazione (500 g per 5 min) 1,5 ml di cultura parassita. Gettare il surnatante e risospendere con 10 ml di appena fatto, riscaldato, medio DMEM incompleta. Ripetere il lavaggio una seconda volta. Risospendere il volume di 30μl di ematocrito, con 1,5 ml di incompleto con 1% di BSA DMEM. </li><li> Lavare i HBEC-5i piatto rivestito di Petri due volte aspirante medio e aggiungendo 3 ml di DMEM incompleta. </li><li> Aggiungere la soluzione di parassiti al HBEC-5i piatto e incubare a 37 ° C per 75 min. Risospendere parassiti due volte (dopo 30 e 60 minuti) durante l'incubazionedelicatamente a dondolo il piatto nelle quattro direzioni, così come in senso orario e antiorario. </li><li> Dopo l'incubazione, lavare il piatto 5 volte aspirando mezzo, utilizzando una pipetta Pasteur di plastica per aggiungere 3 ml di medium caldo DMEM incompleti, rock e leggera. Se molti piatti vengono utilizzati, tenerli su di una superficie calda, come un gran fiasco pieno d'acqua a 37 ° C. </li><li> Controllare il piatto sotto un microscopio invertito. Se molti dei globuli rossi infetti sono ancora visibili, fare di più lavaggi come descritto sopra. Maneggiare la piastra Petri con molta attenzione per evitare qualsiasi rischio di contaminazione. </li><li> Rimuovere media dal piatto e aggiungere 3 ml di medium caldo RPMI completo con 40μl di ematocrito di uRBC fresca. </li><li> Porre la capsula in una camera stagna in incubazione, il gas per 3 minuti e il luogo della camera in un incubatore a 37 ° C durante la notte. </li><li> Il giorno dopo, raccogliere i parassiti dal lavaggio con media RPMI incompleta, in modo simile a quanto descritto nel paragrafo 4.4. ma più vigorosamente. Keep tutti mezzo utilizzato (contenente risospeso RBC) in un tubo 15ml conica. Controllare al microscopio invertito che tutte le RBC sono state rimosse dal piatto. </li><li> Pellet i parassiti, scartare il surnatante, risospendere in 5ml media RPMI completo e inserire il composto in un recipiente per la coltura normale. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Parassiti non selezionati mostrano un basso livello di legame HBEC-5i (Figura 3A). Così, dopo il primo turno di selezione, parassiti molto pochi saranno raccolti e può richiedere fino a un mese di coltura per raggiungere una parassitemia sufficiente per il secondo round di selezione. Dopo ogni turno di selezione, parassiti sempre più si legano alle cellule endoteliali e le selezioni possono essere ripetuti ad intervalli di tempo più brevi. Dopo 4-5 giri di selezione, ad alta vincolante popolazioni parassita sono ottenuti (Figura 3). Nelle nostre mani, il legame di HB3-HBEC a HBEC-5i o TNF attivato HBEC-5i era di simmili livello (dati non riportati). Il protocollo qui descritto è stato testato con 4 P. ceppi di P. falciparum: HB3, IT/FCR3, 3D7 e DD2 (Tabella 1). Solo quest'ultimo non si è dimostrato in grado di legarsi a HBEC-5i, anche dopo 5 turni di selezione. HB3 parassiti sono stati anche selezionati per cytoadherence di cellule microvascolari cutanea e polmonare endoteliale (HDMEC e HPMEC). Dopo 4 turni di selezione, secondo il metodo descritto qui, un alto legame popolazione sono stati ottenuti su entrambi i HDMEC e HPMEC (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Panoramica del processo di selezione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Stadi di sviluppo di P. falciparum globuli rossi infetti. Striscio Giemsa visualizzati al microscopio con ingrandimento 1000X. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Tipico esempio di parassiti legame HBEC-5i. (A) Lo strato blu è HBEC-5i fissati con glutaraldeide e colorati con Giemsa, visualizzati al microscopio con ingrandimento 1000X. Le foto sono state scattate dopo uRBC e iRBC non legato sono state spazzate via. Il pannello a sinistra mostra un unico P. falciparum HB3 (non selezionato) parassita legato a HBEC-5i. Nel pannello di destra la HB3-HBEC parassiti erano stati selezionati per 5 round. (B) I dati rappresentano la media di due esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito in duplice copia. Il numero di parassiti legati per cellule endoteliali è stato contato. <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/3122/3122table1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabella 1"> Tabella 1. Sintesi dei ceppi di Plasmodium falciparum, che si sono selezionati per il legame a HBEC-5i. HB3 Si noti che è stato anche selezionato per il TNF-attivato HBCE-5i. Dopo 5 turni di selezione, il ceppo DD2 non ha mostrato alcun aumento del legame con HBEC-5i rispetto ai non selezionati-DD2. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3122/3122fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Legame di P. falciparum HB3 parassiti cutanea (HDMEC) e polmonare (HPMEC), le cellule endoteliali, prima e dopo 4 turni di selezione. Anche se il terreno di coltura per HDMEC e HPMEC differisce leggermente (vedi istruzioni del fornitore), il protocollo utilizzato per la selezione era identico come HBEC-5i. Foto scattate con ingrandimento 400X. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> DMEM-F12 Ham </td><td> Sigma </td><td> D6421 </td><td> Per le medie DMEM completo </td></tr><tr><td> L-glutammina 200mm </td><td>GIBCO </td><td> 25030 </td><td> Per le medie e DMEM RPMI completo </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina 100X (10000 unità / ml e 10 mg) </td><td> ScienCell </td><td> 0503 </td><td> Per le medie DMEM completo </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino inattivato al calore </td><td> ScienCell </td><td> 0025 </td><td> Per le medie DMEM completo </td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (0,025% tripsina, 0.5mm EDTA) </td><td> ScienCell </td><td> 0103 </td><td></td></tr><tr><td> Supplemento di crescita delle cellule endoteliali </td><td> ScienCell </td><td> 1052 </td><td> Per le medie DMEM completo </td></tr><tr><td> Cultura tessuto trattato 60 mm x 15 millimetri Petri </td><td> BD </td><td> 353002 </td><td></td></tr><tr><td> Fibronectina umana </td><td> Millipore </td><td> FC010 </td><td> Utilizzare a 2 mg / cm 2 </td></tr><tr><td> TNF </td><td> R &amp;D Systems </td><td> 210-TA </td><td> opzionale, l'uso a 50 mcg / ml </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Lonza </td><td> BE12-167F </td><td> Per le medie RPMI completo </td></tr><tr><td> Gentamicina 50mg/ml </td><td> Lonza </td><td> 17-518Z </td><td> Per le medie RPMI completo </td></tr><tr><td> Hepes 1M </td><td> Lonza </td><td> Be17-737E </td><td> Per le medie RPMI completo </td></tr><tr><td> HDMEC </td><td> ScienCell </td><td> 2000 </td><td> Linea di cellule primarie </td></tr><tr><td> HPMEC </td><td> ScienCell </td><td> 3000 </td><td> Linea di cellule primarie </td></tr><tr><td> HBEC-5i </td><td></td><td></td><td> Ottenuto da Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Materiali

<ol><li>Scherf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+malaria%3A+in+situ+switching%2C+relaxed+and+mutually+exclusive+transcription+of+var+genes+during+intra-erythrocytic+development+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum.</a> Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).</li>
<li>MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cerebral+malaria.+A+quantitative+ultrastructural+analysis+of+parasitized+erythrocyte+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration.</a> Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).</li>
<li>Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+and+intensity+of+parasite+sequestration+in+comatose+Malawian+children%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children.</a> J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).</li>
<li>Taylor, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+the+pathologies+of+cerebral+malaria+by+postmortem+parasite+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts.</a> Nat. Med. 10, 143-145 (2004).</li>
<li>van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unified+hypothesis+for+the+genesis+of+cerebral+malaria%3A+sequestration%2C+inflammation+and+hemostasis+leading+to+microcirculatory+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction.</a> Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).</li>
<li>Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+characterization+of+microvascular+endothelial+cells+derived+from+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain.</a> Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).</li>
<li>Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+to+human+cells%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications.</a> Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).</li>
<li>Xiao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+involvement+of+additional+receptors+in+the+cytoadherence+of+infected+erythrocytes+to+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells.</a> Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).</li>
<li>Corrigan, R. A., Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+variation+in+early+innate+cytokine+induction+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum.</a> Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).</li>
<li>Rowe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+mycoplasma+contamination+in+Plasmodium+falciparum+cultures+and+methods+for+its+detection+and+eradication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).</li>
<li>Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoll%2C+K+%22Methods+in+Malaria+Research%22">Methods in Malaria Research</a>. , MR4/ATCC. (2009).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li>
<li>Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deformability+limits+of+Plasmodium+falciparum-infected+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells.</a> Cell. Microbiol. , (2009).</li>
<li>Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum-infected+erythrocyte+receptor%28s%29+for+CD36+and+thrombospondin+are+restricted+to+knobs+on+the+erythrocyte+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface.</a> J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).</li>
<li>Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMP-420%2C+a+new+therapeutic+approach+for+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria.</a> Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).</li>
<li>Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+potentiate+brain+endothelial+alterations+induced+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum.</a> Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Il segno distintivo della malaria cerebrale è il sequestro di P. falciparum iRBC all&#39;interno del cervello microcircolo 2, 3. Tuttavia, in colture in vitro di P. falciparum solo poco cytoadhere a HBEC-5i, un modello per endotelio microvascolare del cervello umano. Qui abbiamo messo a punto un test semplice per arricchire una popolazione per il legame a HBEC-5i, una più &quot;in vivo come&quot; fenotipo. Tre su 4 P. ceppi di P. falciparum sono stati scelti con successo utilizzando questo metodo. Inoltre, HB3 è stato anche selezionato HDMEC e HPMEC, indicando che questo protocollo può essere utilizzato per vari tipi di parassita delle cellule endoteliali. Diverse ipotesi può spiegare la mancanza di legame con il ceppo DD2. La più probabile è il fatto che questa linea parassita è knobless, che ostacola fortemente il cytoadherence 13, 14. Si consiglia di parassiti coltura selezionata insieme al pro selezionecesso per fornire un controllo per il confronto. Ciò consentirà, ad esempio, confrontando il trascrittoma di parassiti vincolanti e non vincolanti, con la speranza di scoprire i candidati ligando parassita. TNF è una citochina trova ad alto livello in pazienti affetti da malaria cerebrale ed è stato spettacolo di indurre l&#39;espressione delle proteine ​​di superficie molte delle HBEC-5i (Claessens et al, in preparazione e 8, 15, 16). In questo caso, la quantità di iRBC legato era simile nei normali HBEC-5i rispetto al attivato HBEC-5i. Questo &quot;modello di sequestro&quot; può essere usato anche per studiare le interazioni molecolari tra il iRBC e le cellule endoteliali, così come l&#39;effetto del presunto anti-cytoadherence farmaci. In questo caso, si consiglia di placcatura HBEC-5i in piccoli pozzi, come ad esempio &quot;8-bene diapositive da camera&quot; (BD 354628) o &quot;CultureWell&quot; (Sigma C7735-20EA).

selezione di plasmodium falciparum parassiti per cytoadhesion alle cellule cerebrali umane endoteliali

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

La maggior parte delle morti per malaria umana è causata dal sangue allo stadio parassiti Plasmodium falciparum. Malaria cerebrale, la complicanza più pericolosa per la vita della malattia, è caratterizzata da un accumulo di Plasmodium falciparum cellule infettate globuli rossi (iRBC) nella prima fase vegetativa pigmentate nel microcircolo del cervello 2-4. Questa ostruzione microvascolare (sequestro) porta ad acidosi, ipossia e nocivi citochine infiammatorie (recensione a 5). Sequestro si trova anche nella maggior parte dei tessuti microvascolari del corpo umano, 2, 3. Il meccanismo con cui iRBC attaccare alle pareti dei vasi sanguigni è ancora poco compresa. Il immortalato umane endoteliali microvascolari cerebrali linea cellulare (HBEC-5i) è stato usato come un modello in vitro di barriera emato-encefalica 6. Tuttavia, Plasmodium falciparum iRBC allegare solo male a HBEC-5i in vitro, a differenza del sequestrat densoione che si verifica in casi di malaria cerebrale. Abbiamo quindi sviluppato un test per selezionare panning (arricchire) varie P. ceppi di P. falciparum per l&#39;adesione al HBEC-5i al fine di ottenere popolazioni di alta vincolante parassiti, più rappresentativo di ciò che accade in vivo. Un campione di una cultura parassita (miscela di iRBC e non infetti RBC) in fase di trofozoite pigmentata viene lavata e incubata su uno strato di HBEC-5i coltivate su una piastra di Petri. Dopo l&#39;incubazione, il piatto viene delicatamente lavato e privo di uRBC iRBC legato. Fresco uRBC vengono aggiunti al iRBC pochi allegata al HBEC-5i e incubato per una notte. Come parassiti fase schizonte scoppio, merozoiti inscatoli reinvade RBC e questi parassiti anello fase vengono raccolte il giorno successivo. I parassiti sono coltivati ​​fino abbastanza materiale si ottiene (in genere 2 a 4 settimane) e un nuovo round di selezione può essere eseguita. A seconda del P. falciparum ceppo, da 4 a 7 giri di selezione sono necessari al fine di ottenere una popolazionedove la maggior parte dei parassiti si legano ai HBEC-5i. Il fenotipo legame è progressivamente perso dopo poche settimane, che indica un interruttore di espressione del gene variante antigene di superficie, quindi la selezione regolari HBEC-5i è necessario per mantenere il fenotipo. In sintesi, abbiamo sviluppato un test di rendering selezione P. falciparum parassiti più &quot;cerebrale adesivo malaria&quot; fenotipo. Siamo stati in grado di selezionare 3 su 4 P. ceppi di P. falciparum in HBEC-5i. Questo test è stato utilizzato con successo anche per selezionare i parassiti per il legame di cellule umane endoteliali cutanea e polmonare. È importante sottolineare che questo metodo può essere usato per selezionare tessuto-specifiche popolazioni di parassiti al fine di individuare ligandi parassita candidato per il legame di endotelio cerebrale. Inoltre, questo test può essere usato per individuare presunti anti-sequestro di droga 7.

Un<em&gt; In vitro</emModello&gt; per il sequestro malaria cerebrale è descritto<sup&gt; 1</sup&gt;.<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Cellule infettate globuli rossi vengono selezionati per legarsi alle cellule del cervello umano immortalato microvascolari endoteliali. I parassiti selezionati mostrano un fenotipo diverso. Il processo di selezione può essere applicato utilizzando vari<em&gt; P. falciparum</em&gt; Ceppi e linee di cellule endoteliali.

Selezione di Plasmodium falciparum Parassiti per Cytoadhesion alle cellule cerebrali umane endoteliali

La maggior parte dei decessi per malaria nell'uomo è causata da parassiti di Plasmodium falciparum allo stadio ematico. La malaria cerebrale, la complicazione più letale della ...

L'obiettivo generale di questa procedura è selezionare plasmodio, fpar e parassiti per il legame con cellule endoteliali cerebrali umane. Questo viene ottenuto innanzitutto incubando una coltura di plasmodio, fpar e parassiti, che contiene una miscela di globuli rossi infetti e non infetti, con uno strato di cellule endoteliali cerebrali umane; successivamente si procede a lavare via i globuli rossi non infetti e non legati, effettuando diversi lavaggi con il mezzo di coltura. Vengono quindi aggiunti globuli rossi freschi per consentire un'ulteriore crescita della popolazione parassitaria.L'ultimo passaggio, alcune settimane dopo, consiste nel ripetere la selezione complessiva non appena viene raggiunta una parasitemia sufficiente. In definitiva, la microscopia viene utilizzata per mostrare un elevato numero di parassiti legati agli HBE five i. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della malaria cerebrale, come l'identificazione di ligandi parassitari o molecole recettrici dell'ospite coinvolte nel processo di citoadesione.Preparare globuli rossi umani da sangue intero di gruppo O positivo separando i globuli rossi dai globuli bianchi mediante il passaggio attraverso un filtro di deplezione dei leucociti. Centrifugare le cellule a 1000 G per 10 minuti e risospendere il pellet in tutto il mezzo PMI incompleto.Ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta, quindi risospendere il pellet. Nel nostro mezzo PMI incompleto al 50% di ematocrito, i globuli rossi vengono conservati a quattro gradi Celsius per una settimana. Coltivare i globuli rossi infettati da Odium Valspar.Con mezzo completo RPMI al 2% di ematocrito, incubare a 37 gradi Celsius con 3% di anidride carbonica, 1% di ossigeno e 96% di azoto ogni giorno. Preparare uno striscio di sangue per valutare lo stadio di sviluppo dei parassiti. Cambiare il mezzo ogni giorno centrifugando la coltura a 500 ×g per cinque minuti.Aspirare il soprannatante ed aggiungere fresco mezzo RPMI completo circa una volta alla settimana. Sincronizzare i parassiti mediante trattamento con sorbitolo acquoso al 5%. Il saggio di selezione può essere eseguito il giorno successivo a una coltura in stadio anellare in cui si osserva un minimo di 5%–10% di parassitemia.In aggiunta, è necessaria una quantità di coltura parassitaria sufficiente a formare un volume cellulare parassitario di 30 microlitri per ogni piatto da 60 millimetri di cellule hbe five eye. Preparare un piatto da coltura tissutale da 60 millimetri per ricevere la linea cellulare di endotelio microvascolare del cervello umano o H back fivei aggiungendo due microgrammi per centimetro quadrato di fibronectina e soluzione salina sterile al piatto.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque-venti minuti, quindi aspirare la soluzione di fibronectina. Successivamente, raccogliere le cellule HBE five I da un flacone per colture tessutali da 25 centimetri quadrati mediante ionizzazione e centrifugazione Reese, sospendere il pellet cellulare in 10 millilitri di DMEM, mezzo completo. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di questa sospensione cellulare alla piastra per colture tessutali trattata con fibronectina e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due-tre giorni, fino a quando la coltura raggiunge una confluenza del 50-100% e le colture di parassiti sono pronte per la citoaian nel giorno del saggio.La coltura di HBE cinque I dovrebbe avere una confluenza compresa tra il 50 e il 100%. La coltura del parassita, invece, dovrebbe trovarsi nella fase di trofozoiti pigmentati, con una parassitemia di almeno dal 5 al 10% e un ematocrito del 2%. Per prima cosa, pipettare 1,5 millilitri di coltura del parassita dalla fiala di coltura e trasferirli in un tubo da centrifuga da 15 millilitri.Centrifugare la coltura a 500 G per cinque minuti e ri-sospendere in 10 millilitri di DMEM incompleto, appena riscaldato. Ripetere questo passaggio di lavaggio una seconda volta al termine della centrifugazione finale.Aspirare il DMEM incompleto, il mezzo, e ri-sospendere il pellet di 30 microlitri in 1,5 millilitri di DMEM incompleto, integrato con il 1% di BSA. Successivamente, recuperare la piastra da 60 millimetri di hvac.Five.Le cellule oculari aspirano il terreno di coltura e vengono lavate due volte con tre millilitri di DMEM. Mezzo incompleto. Aggiungere la soluzione di parassiti, la piastra di HPE con cinque cellule oculari e incubare nell'incubatore per colture cellulari per un totale di 75 minuti.Due volte durante l'incubazione, risospendere i parassiti agitando delicatamente e ruotando la piastra secondo l'incubazione. Lavare la piastra cinque volte aspirando il mezzo con una pipetta di plastica e aggiungendo tre millilitri di mezzo DMEM incompleto tiepido; dopo l’ultimo lavaggio, agitare dolcemente la piastra ed esaminarla al microscopio invertito. Se sono ancora visibili molte emazie non infette, ripetere la procedura di lavaggio come descritto sopra per rimuoverle.Dopo aver aspirato il mezzo dalla piastra, risospendere 40 microlitri di volume cellulare concentrato di globuli rossi freschi in mezzo RPMI completo temperato e aggiungere la sospensione cellulare alla piastra. Posizionare la piastra in una camera di incubazione aerata. Quindi gassare la piastra con 3% di anidride carbonica, 1% di ossigeno e 96% di azoto per tre minuti.E posizionare la camera in un incubatore a 37 gradi Celsius per tutta la notte. Durante questa incubazione, i parassiti allo stadio schizogonico si rompono e i maiti reinvasano i globuli rossi. Il giorno successivo, raccogliere i parassiti allo stadio anellare mediante lavaggio.Con mezzo RPMI incompleto, in modo analogo a quanto fatto in precedenza, ma con una pipettatura più energica del mezzo e oscillazione della piastra. Conservare tutto il mezzo utilizzato, che conterrà i globuli rossi risospesi, in un tubo conico da 15 millilitri. Esaminare la piastra al microscopio invertito per assicurarsi che tutti i globuli rossi siano stati rimossi dalla capsula prima della centrifugazione.Il tubo contenente il mezzo della piastra lavata viene centrifugato per formare il pellet dei parassiti; scartare il sopranatante e risospendere in cinque millilitri di mezzo RPMI completo, quindi trasferire la sospensione in un fiasco da 25 centimetri quadrati per la coltivazione. I parassiti vengono coltivati per due-quattro settimane fino a ottenere una quantità sufficiente di materiale e poter eseguire un nuovo ciclo di selezione.I parassiti HB tre non selezionati mostrano un basso livello di legame con le cellule endoteliali oculari hbe cinque. Questa immagine mostra le cellule endoteliali oculari hbe cinque fissate con glutaraldeide al 2% e colorate con Giemsa, osservate al microscopio con un ingrandimento di 1000 volte. Le immagini sono state acquisite dopo aver lavato via i globuli rossi non infetti e i globuli rossi infetti non legati. Dopo ogni ciclo di selezione, un numero sempre maggiore di parassiti si lega alle cellule endoteliali e i cicli di selezione possono essere ripetuti a intervalli di tempo più brevi dopo cinque round di selezione.Si ottengono popolazioni di parassiti ad alto legame, come mostrato qui con i parassiti HB tre HBE. Questa tabella mostra un riepilogo dei ceppi di plasmodio alspar che sono stati selezionati con successo per il legame con HE cinque. Si osserva che HB tre è stato inoltre selezionato su HE cinque attivato da TNF dopo cinque cicli di selezione.La ceppa DD due non ha mostrato alcun aumento del legame con HBE cinque I rispetto al DD due non selezionato. Questa immagine a 400 volte di ingrandimento mostra il legame dei parassiti plasmodium alspar HB tre con cellule endoteliali dermiche HD MEK prima della selezione. Qui viene mostrato il legame dei parassiti plasmodium alspar HB tre con la stessa linea cellulare endoteliale dermica dopo quattro cicli di selezione.Questa figura mostra il legame dei parassiti Plasmodium spar HB3 con le cellule endoteliali polmonari HPME prima della selezione. Ora il legame dei parassiti Plasmodium spar HB3 con le cellule HPME è aumentato dopo quattro cicli di selezione. Sebbene il mezzo di coltura per HDE, C e HPEC differisca leggermente, il protocollo utilizzato per la selezione era identico a quello impiegato per HBE5I. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti metodi come RT-PCR o microanalisi per rispondere a ulteriori domande, ad esempio caratterizzare la trascrizione dell'antigene di superficie variabile nei parassiti non selezionati e in quelli selezionati.

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Selezione di Plasmodium falciparum Parassiti per Cytoadhesion alle cellule cerebrali umane endoteliali

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