Name: Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Scopri un protocollo per la microdissezione di regioni cerebrali discrete nel topo per l'estrazione di RNA totale di alta qualità. Questo metodo consente profili di espressione genica affidabili per studi di neuroscienza.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) e dall'Army Research Office (ARO), numero del contributo W911NF-10-1-006.

1. Configurazione e preparazione del campionamento
<ol>
	<li>Integrare la soluzione salina equilibrata di Earle (EBSS) con bicarbonato di sodio (0,44 g per 100 mL di EBSS) e glucosio (0,884 g per 100 mL di EBSS)9. Trattare l'EBSS con DEPC (0,1 mL per 100 mL di EBSS) per almeno 12 ore a 37 °C in un contenitore o flacone autoclavabile con tappo a vite.</li>
	<li>Posizionare 5 pipette di Pasteur in vetro da 5 ¾" in un becher di vetro da 1000 mL e inserire i pennelli da disegno, con le setole rivolte verso l'alto, in un cilindro graduato di vetro da 100 mL. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di DEPC (0,1 mL per 100 mL di ddH2O) per coprire rispettivamente le pipette e i pennelli. Coprire il becher e il cilindro graduato con carta d'alluminio e incubare per almeno 12 ore a 37 °C.</li>
	<li>Dopo l'incubazione di 12 ore con DEPC, riscaldare tutti i materiali trattati con DEPC a una temperatura &gt;100 °C per almeno 15 minuti. Rimuovere l'EBSS e farlo raffreddare a temperatura ambiente prima di conservarlo a 4 °C. Versare l'acqua ddH2O lontano dal becher e dal cilindro graduato; continuare l'incubazione a &gt;100 °C finché i materiali non saranno completamente asciutti. Rimuoverli, farli raffreddare a temperatura ambiente e conservarli per un uso successivo.</li>
	<li>Nel giorno dell'esperimento, trattare tutte le superfici di lavoro con RNaseZap.</li>
	<li>Posizionare e mantenere l'EBSS in un bagno termostatato regolato a 40 °C. Per tamponare e ossigenare l'EBSS, saturare con una miscela di gas 95%/5% O2/CO2 inserendo un tubo del gas in una pipetta di Pasteur priva di RNasi e immergendo la pipetta nell'EBSS. Coprire l'apertura del contenitore dell'EBSS.</li>
	<li>Preparare un tagliacampione tissutale Stoelting per sezionare in serie il tessuto cerebrale. Trattare le superfici superiore e inferiore del tagliacampione con RNaseZap. Fissare un pezzo rettangolare di carta da filtro Whatman n. 4 sulla superficie in plexiglass del tagliacampione. Montare una lama doppio-tagliente sul braccio del tagliacampione. Impostare il micrometro su zero e regolare l'altezza minima del braccio in modo che la lama tagli la carta da filtro senza danneggiare la piastra in plexiglass.</li>
	<li>Raccogliere tutti gli altri materiali necessari per la microdissezione, inclusi piatti per colture cellulari RNasi-free da 60x15 mm, corer tissutali Harris Uni-Core, puntali per micropipetta da 200 μL privi di RNasi da applicare ai tubi del gas per l'ossigenazione dell'EBSS durante il prelievo di campioni da sezioni coronali del cervello, forbici curve, ghiaccio secco e provette per il recupero del tessuto. Posizionare le provette sul ghiaccio secco.</li>
</ol>
2. Rimozione del cervello e sezione coronale
<ol>
	<li>Posizionare il topo in un DecapiCone e decapitarlo utilizzando una ghigliottina per roditori. Rimuovere la testa dal DecapiCone e appoggiarla su una superficie piana. Con un bisturi, praticare un'incisione cutanea lungo la linea mediana del cranio, a partire da circa 3 mm caudalmente alle narici. Sollevare lateralmente i lembi cutanei per esporre il cranio e le orbite oculari.</li>
	<li>Utilizzando forbici curve, recidere i due nervi ottici, interrompendo la loro connessione con l'occhio. Aprire la cavità cranica rompendo con attenzione le ossa occipitale e interparietale ed eliminando le ossa parietali dorsali e frontali. Con un rongeur osseo, frantumare le ossa nasali e lacrimali per esporre i bulbi olfattivi. Usare le forbici curve per staccare i bulbi olfattivi dalla porzione rostrale del cervello. Rimuovere l'intero cervello mantenendo intatto il metencefalo. Posizionare il cervello nella parte superiore di una piastra per colture cellulari Cellstar da 60 x 15 mm, priva di RNasi. Trasferire sulla superficie di lavoro per il campionamento del tessuto.</li>
	<li>Utilizzare una pipetta priva di RNasi per inumidire moderatamente la carta filtro fissata al taglia-tessuti con EBSS. Inumidire il tessuto cerebrale con EBSS.</li>
	<li>Trasferire il cervello sul taglia-tessuti e posizionarlo correttamente. Nota: il cervello deve essere posizionato con la superficie ventrale appoggiata sulla carta filtro. La linea mediana (fessura interemisferica) deve essere perpendicolare alla lama del taglia-tessuti, e il margine rostrale del cervello deve aderire alla lama.</li>
	<li>Utilizzare un pennello da artista trattato con DEPC per mantenere fermo il cervello applicando una leggera pressione sulla superficie dorsale. Mentre si tiene fermo il cervello, sollevare la leva del supporto della lama di circa 4-5 cm al di sopra della superficie dorsale del tessuto e mantenerla in questa posizione. Rimuovere il pennello dalla superficie cerebrale e regolare la micrometrica su 750 μm. Lasciare cadere la leva, tagliando il tessuto e producendo una sezione coronale di 750 μm.</li>
	<li>Mantenendo la lama del taglia-tessuti ferma, utilizzare un movimento rotatorio del pennello da artista per spostare delicatamente la sezione di tessuto dalla superficie della lama. Posizionare immediatamente la sezione di tessuto nell'EBSS ossigenato presente nella piastra di Petri. Un secondo operatore può iniziare dal passaggio 3.1.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.5 e 2.6 fino a ottenere sezioni seriali del cervello lungo l'intero piano rostro-caudale.</li>
</ol>
3. Microdissezione di regioni cerebrali
<ol>
	<li>Regolare l'illuminazione per garantire che l'illuminazione del campione non venga ostacolata durante la microdissezione del tessuto. Regolare la posizione e il flusso della miscela 95%/5% di O2/CO2 per mantenere un ambiente tamponato e ossigenato per il tessuto durante la microdissezione.</li>
	<li>Individuare la sezione cerebrale coronale che comprende la regione di interesse. Orientare la sezione cerebrale in posizione piatta sul fondo della piastra di Petri utilizzando un pennello da artista. Selezionare il corer per tessuti con il diametro appropriato in base alla Tabella 1 o ad altre referenze. Mentre si tiene ferma la sezione di tessuto coronale con il pennello da artista, abbassare la punta del corer sulla superficie della sezione di tessuto.</li>
	<li>Applicando pressione, spingere la punta del corer attraverso la sezione di tessuto fino a farla aderire saldamente al fondo della piastra di Petri. Utilizzare un movimento circolare rotatorio per assicurarsi che la regione di interesse sia stata dissociata dal tessuto circostante. Sollevare con attenzione il corer dalla sezione di tessuto e rilasciare il microprelievo, permettendogli di galleggiare nell'EBSS.</li>
	<li>Utilizzando un pennello da artista, depositare immediatamente il microprelievo di tessuto in una provetta stabile a -80 °C mantenuta su ghiaccio secco. Il tessuto dovrebbe aderire facilmente alla parete della provetta. Riporre nuovamente la provetta contenente il microcampione sul ghiaccio secco.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.2 - 3.4 per ciascuna regione cerebrale di interesse.</li>
</ol>
4. Archiviazione del tessuto
<ol>
	<li>Al termine della microdissezione, utilizzare il sistema scanner VisionMate per registrare i codici a barre corrispondenti a ciascun tubo TrakMates contenente campioni. Una volta riempito il rack per tubi TrakMates da 96 posizioni, scansionare rapidamente il rack e inserire immediatamente i campioni di tessuto in un congelatore a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA.</li>
</ol>
5. Estrazione di RNA totale
<ol>
	<li>Preparare un'area di lavoro priva di RNasi utilizzando RNaseZap. Preparare una quantità sufficiente di miscela di perle magnetiche e soluzione di lisi/legame come descritto nel protocollo MagMAX-96 per l'isolamento totale di RNA10.</li>
	<li>Rimuovere i campioni di tessuto dal congelatore a -80 °C e posizionare immediatamente i tubi su ghiaccio secco.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di soluzione di lisi/legame a un tubo TrakMates contenente il campione. Applicare un pestello di dimensioni adatte a un tubo da 0,5 ml privo di nucleasi al miscelatore di pellet e omogeneizzare il tessuto. Trasferire, utilizzando una punta di pipetta priva di nucleasi a bassa ritenzione, il campione omogeneizzato in una pozzetta di una piastra per colture cellulari rotonda a 96 pozzette. Aggiungere immediatamente 60 μL di isopropanolo al 100% al campione mediante una punta di pipetta priva di nucleasi a bassa ritenzione e mescolare aspirando e dispensando 3-4 volte.</li>
	<li>Aggiungere 20 μL della miscela di perle al campione utilizzando una punta di pipetta priva di nucleasi a bassa ritenzione. Mescolare aspirando e dispensando 3-4 volte.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 5.3-5.4 per tutti i campioni di tessuto.</li>
	<li>Seguire i passaggi del protocollo MagMAX-96 per l'isolamento totale di RNA a partire dal punto III.A.2 per completare l'estrazione totale di RNA. NOTA: Sono disponibili in commercio altri kit per l'isolamento totale di RNA basati su perle magnetiche; tuttavia, non sono stati esaminati nel presente studio. Si prega di consultare i manuali dei produttori per i dettagli relativi all'isolamento totale di RNA con i rispettivi prodotti.</li>
	<li>Misurare la purezza e la concentrazione dell'RNA totale ottenuto mediante uno spettrofotometro NanoDrop 3300 o altre tecnologie spettrofotometriche/fluorimetriche per volumi ridotti.</li>
</ol>
6. Risultati rappresentativi:
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Regione/Centro cerebrale</td>
			<td>Diametro del campionatore tissutale (mm)</td>
			<td>RNA totale (ng/μL)</td>
			<td>Rapporto 260/280</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corteccia frontale</td>
			<td>2,0</td>
			<td>27,03</td>
			<td>1,99</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleo accumbens</td>
			<td>1,0</td>
			<td>6,26</td>
			<td>2,77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Striato</td>
			<td>1,5</td>
			<td>27,94</td>
			<td>2,19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corteccia cingolata</td>
			<td>1,5</td>
			<td>29,05</td>
			<td>2,07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ipotalamo - Nucleo paraventricolare / Nucleo sopraottico (PVN/SCN)</td>
			<td>2,0</td>
			<td>40,34</td>
			<td>2,03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talamo</td>
			<td>2,0</td>
			<td>34,40</td>
			<td>2,00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ipotalamo - Nucleo dorsomediale / Nucleo ventromediale (DMH/VMH)</td>
			<td>2,0</td>
			<td>44,83</td>
			<td>2,05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amygdala</td>
			<td>1,0</td>
			<td>10,06</td>
			<td>1,89</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ipocampo - Ca 2/3</td>
			<td>1,5</td>
			<td>7,31</td>
			<td>2,32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ipocampo - Ca1/Giro dentato</td>
			<td>1,5</td>
			<td>5,20</td>
			<td>2,24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grigio periacqueduttale</td>
			<td>1,0</td>
			<td>48,21</td>
			<td>2,02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleo raphe dorsale</td>
			<td>1,0</td>
			<td>6,56</td>
			<td>2,18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formazione reticolare</td>
			<td>2,0</td>
			<td>35,35</td>
			<td>2,27</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1. Enumerazione delle regioni cerebrali di topo microdissezionate con i rispettivi diametri ottimali del corer per tessuti, resa totale rappresentativa di RNA e purezza. Le 13 regioni cerebrali microdissezionate, elencate in ordine rostro-caudale, variano per dimensione e orientamento. Il prelievo micropunzonato dell'PVN/SCN comprende il nucleo paraventricolare anteromediale, porzioni del nucleo periventricolare, la zona subparaventricolare e altri neuroni parvocellulari. Il prelievo micropunzonato del talamo comprende nuclei talamici anteriori situati nello stesso piano coronale della regione del prelievo micropunzonato PVN/SCN. Il prelievo micropunzonato DMH/VMH comprende nuclei magnocellulari accessori e altri neuroni parvocellulari situati tra il nucleo dorsomediale e il nucleo ventromediale. Il campione dell'amigdala include sia le sottoregioni centrale che basolaterale. La resa di RNA e i rapporti 260/280 sono valori singoli ottenuti da rispettivi campioni di microdissezione per dimostrare i valori rilevati per ciascuna regione cerebrale.

<ol><li>Pickrell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+mechanisms+underlying+human+gene+expression+variation+with+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Understanding mechanisms underlying human gene expression variation with RNA sequencing.</a> Nature. 464, 768-772 (2010).</li>
<li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> J. Biomed. Biotechnol. 853916, (2010).</li>
<li>Nagalakshmi, U., Waern, K., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+method+for+comprehensive+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a method for comprehensive transcriptome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 4, 11-13 (2010).</li>
<li>Anglicheau, D., Muthukumar, T., Suthanthiran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+small+RNAs+with+big+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: small RNAs with big effects.</a> Transplantation. 90, 105-112 (2010).</li>
<li>Forrest, A. R., Carninci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+genome+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA.+Biol%22%5BJournal%5D)">Whole genome transcriptome analysis.</a> RNA. Biol. 6, 107-112 (2009).</li>
<li>Twine, N. A., Janitz, K., Wilkins, M. R., Janitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+sequencing+reveals+gene+expression+and+splicing+differences+in+brain+regions+affected+by+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome sequencing reveals gene expression and splicing differences in brain regions affected by Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6, e16266-e16266 (2011).</li>
<li>Paulsen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+individual+hypothalamic+nuclei+from+single+animals+using+laser+capture+microdissection+and+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of individual hypothalamic nuclei from single animals using laser capture microdissection and microarrays.</a> J. Neurosci. Methods. 177, 87-93 (2009).</li>
<li>Winrow, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+anatomical+isolation+of+functional+sleep+circuits+exhibits+distinctive+regional+and+circadian+gene+transcriptional+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles.</a> Brain. Res. 1271, 1-17 (2009).</li>
<li>Atkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+integration+of+glutamatergic+signals+by+little+SAAS+in+novel+suprachiasmatic+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Circadian integration of glutamatergic signals by little SAAS in novel suprachiasmatic circuits.</a> PLoS One. 5, e12612-e12612 (2010).</li>
<li>Technologies, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTechnologies%2C+L+%22MagMAX-96+Total+RNA+Isolation+Kit+Instruction+Manual%22">MagMAX-96 Total RNA Isolation Kit Instruction Manual</a>. , Forthcoming.</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

In questo protocollo esistono molti passaggi critici che richiedono un'attenta considerazione e attenzione. La scelta del diametro appropriato del corer per tessuti deve essere determinata in base alla rimozione di ciascuna specifica regione di interesse. Sebbene i diametri del corer per tessuti riportati nella Tabella 1 siano adatti al prelievo delle regioni cerebrali elencate, ogni ricercatore dovrebbe stabilire le dimensioni ottimali del corer per un prelievo efficiente del proprio tessuto (o dei propri tessuti) di in...

<table><tbody><tr><td>Bagno termostatato Isotemp 102</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-3Q</td><td></td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9782</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale da laboratorio</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>2314 &amp;#8211;- 1CEQ</td><td></td></tr><tr><td>Miscelatore per pellet</td><td>VWR international</td><td>47747-370</td><td></td></tr><tr><td>Pestello da 0,5 mL privo di RNasi</td><td>VWR international</td><td>KT749521-0590</td><td>Privato di nucleasi</td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonato (DEPC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Lame di rasoio a doppio taglio</td><td>Stoelting Co.</td><td>51427</td><td></td></tr><tr><td>St&amp;#8211;Affettatrice per tessuti con micrometro manuale</td><td>Stoelting Co.</td><td>51425</td><td></td></tr><tr><td>Artista 2/0 tondo&amp;rsquo;spazzola s</td><td>Princeton Art Brush</td><td>4350R</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core, corer per tessuti (0,75 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15072</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core, corer per tessuti (1,0 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15099</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core, corer per tessuti (1,5 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15075</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-Core, corer per tessuti (2,0 mm)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>15076</td><td></td></tr><tr><td>Ghigliottina</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>RG-100</td><td></td></tr><tr><td>DecapiConi</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>MDC-200</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Earle&amp;rsquo;una soluzione equilibrata di sali (EBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30029.02</td><td></td></tr><tr><td>pipette da 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td>Privato di nucleasi</td></tr><tr><td>epT.I.P.S. Punte per pipetta LoRetention con doppio filtro, 20 &amp;mdash; 300 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>0030 077.636</td><td></td></tr><tr><td>Tubi con tappo a vite TrakMates</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3741</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di codici a barre 2D wireless VisionMate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3122MTX</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di codici a barre 2D VisionMate SR con singolo alloggiamento</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>3115</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &amp;mu;Punte per pipetta universali</td><td>Corning</td><td>4864</td><td>Privato di nucleasi</td></tr><tr><td>Piatti per coltura cellulare Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td>Privato di nucleasi</td></tr><tr><td>Piastra da coltura cellulare Greiner Bio-One in polistirene, 96 pozzetti, fondo rotondo</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>5665-0180</td><td>Privato di nucleasi</td></tr><tr><td>#4 Carta da filtro</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>1004 150</td><td></td></tr><tr><td>Pompetta per pipette di sicurezza a bulbo in silicone</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-102A</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 Spettrofotometro</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

non laser capture microscopy approccio per la microdissezione delle regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di rna e valle next-generation sequencing e profili di espressione genica

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Come piattaforme tecnologiche, approcci come il sequenziamento di nuova generazione, il microarray e la qRT-PCR hanno un grande potenziale per ampliare la nostra comprensione dell'ampia regolazione molecolare. Approcci più recenti, come il sequenziamento dell'RNA ad alta risoluzione (RNA-Seq)1, forniscono informazioni nuove ed estese sull'espressione specifica di tessuto o di stato, quali i livelli relativi dei trascritti, lo splicing alternativo e i microRNA2-4. Le prospettive di applicazione del metodo RNA-Seq nel confronto del profilo dell'intero trascrittoma5 all'interno di tessuti distinti o tra gruppi di individui fenotipicamente diversi offrono nuove vie per chiarire i meccanismi molecolari coinvolti negli stati fisiologici sia normali che anomali. Recentemente, il profilo dell'intero trascrittoma è stato effettuato su tessuto cerebrale umano, identificando differenze nell'espressione genica associate al decorso della malattia6. Tuttavia, l'uso del sequenziamento di nuova generazione non è ancora stato ampiamente integrato negli studi su mammiferi.
Studi sull'espressione genica in modelli murini hanno riportato profili distinti all'interno di vari nuclei cerebrali, utilizzando la microscopia a cattura laser (LCM) per l'escissione del campione7,8. Sebbene la LCM consenta la raccolta di campioni con precisione a livello di singola cellula e di regioni cerebrali discrete, i rendimenti relativamente bassi di RNA totale ottenuti con questo approccio possono rappresentare un ostacolo per l'RNA-Seq e altre tecniche di profilazione nei tessuti cerebrali murini, richiedendo talvolta passaggi di amplificazione del campione subottimali. In questo lavoro viene presentato un protocollo per la microdissezione ed estrazione di RNA totale da regioni cerebrali murine discrete. Vengono utilizzati corer tissutali di diametro prefissato per isolare 13 tessuti da sezioni coronali seriali da 750 μm di un singolo cervello murino. I campioni ottenuti mediante microprelievo tissutale vengono immediatamente congelati e archiviati. L'RNA totale viene ottenuto dai campioni mediante tecnologia di isolamento di RNA totale basata su microsfere magnetiche. Gli RNA risultanti presentano resa e qualità adeguate per l'utilizzo in analisi di profilazione dell'espressione genica successive. Questa strategia di microdissezione rappresenta un'opzione praticabile rispetto alle attuali metodiche di raccolta dei campioni per ottenere RNA totale da regioni cerebrali discrete, aprendo nuove possibilità per scoperte nell'espressione genica.

Il profilo dell'espressione dell'RNA in regioni cerebrali murine discrete richiede una strategia di raccolta dei tessuti precisa e ripetibile. Viene qui descritto un protocollo che utilizza sia il sezionamento coronale del cervello sia la microdissezione assistita da corer tissutale. Il rendimento e la qualità dell'RNA totale ottenuti dai campioni risultanti confermano l'utilità del metodo delineato.

Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica

Come piattaforme tecnologiche, approcci quali il sequenziamento di nuova generazione, il microarray e la qRT-PCR sono molto promettenti per ampliare la nostra comprensione di ...

L'obiettivo generale di questa procedura è raccogliere RNA totale da nuclei cerebrali discreti in modo ripetibile, consistente, economico e privo di RNAsi. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto un ambiente di lavoro privo di RNAsi ed estraendo l'intero cervello da un topo decapitato. Successivamente, un tagliere per tessuti azionato da micrometro viene utilizzato per ottenere sezioni seriali di tessuto di dimensioni uniformi.Successivamente, le regioni cerebrali di interesse vengono microdissecate utilizzando un campione di tessuto di diametro definito, mantenendo il tessuto in un ambiente privo di RNA. Infine, l'RNA totale viene isolato dai nuclei cerebrali escissi. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano una resa e qualità sufficienti di RNA totale per la preparazione di librerie di cDNA e il profilo del trascrittoma mediante saggi spettrofotometrici o fluorometrici.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'anatomia macroscopica o l'escissione di regioni cerebrali assistita da microscopia a cattura laser, è che è possibile raccogliere da un singolo cervello murino molteplici regioni cerebrali distinte in modo ripetibile e sufficientemente conveniente in termini di costi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, ad esempio se profili distinti di espressione trascrizionale all'interno di regioni cerebrali associate a circuiti neuronali non possano essere correlati a determinati tratti comportamentali, risposte ambientali e/o stati patologici. Per prepararsi alla microdissezione, aggiungere a 100 millilitri di soluzione salina equilibrata di Earle (EBSS) 0,44 grammi di bicarbonato di sodio e 0,884 grammi di glucosio.Trattare l'EBSS con 0,1 millilitri di DEPC in un flacone o beuta autoclavabile con tappo a vite per almeno 12 ore. A 37 gradi Celsius. Posizionare pipette di vetro di cinque pollici e tre quarti in un beuta di vetro da un litro e inserire i pennelli da disegno con le setole rivolte verso l'alto in un cilindro graduato di vetro da 100 millilitri.Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione di acqua trattata con DEPC per coprire le pipette e i pennelli. Coprire il becher e il cilindro graduato con carta d'alluminio e incubare per almeno 12 ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione di 12 ore con il DEPC, riscaldare tutti i materiali trattati con il DEPC a una temperatura superiore a 100 gradi Celsius per almeno 15 minuti. Raffreddare. L'EBSS a temperatura ambiente prima dello stoccaggio a quattro gradi Celsius.Versare l'H2O DD dal becher e dal cilindro graduato e continuare a incubarli a una temperatura superiore a 100 gradi Celsius fino a quando i materiali non saranno completamente asciutti. Rimuoverli dall'incubatrice, farli raffreddare a temperatura ambiente e conservarli per un uso successivo. Nel giorno dell'esperimento, trattare tutte le superfici di lavoro per eliminare la contaminazione da RNA e posizionare il EBSS in un bagnomaria regolato a 40 gradi Celsius per tamponarlo e ossigenarlo.Infiltrare l'EBSS con il 5% di CO2 e il 95% di ossigeno inserendo un tubo per gas in una pipetta da pascolo priva di RNA e introducendo la pipetta nell'EBSS, coprendo l'apertura del contenitore dell'EBSS. Impostare un tagliacampione per il sezionamento in serie del tessuto cerebrale.Trattare le superfici superiore e inferiore del taglia tessuti. Per rimuovere la contaminazione da RNA, fissare un pezzo rettangolare di carta da filtro Watman numero quattro sulla superficie in plexiglass del tritacarne per tessuti. Fissare una lama a doppio taglio al braccio del tritacarne.Impostare il micrometro su zero e regolare l'altezza minima del braccio del tritacarte in modo che la lametta possa tagliare la carta filtro, ma non la piastra in plexiglass. Raccogliere tutti i materiali aggiuntivi necessari per la microdissezione, inclusi piatti per colture cellulari sterili privi di RNA di dimensioni 60 per 15 millimetri, puntali per micropipetta curvi da 200 microlitri privi di RNA, forbici curve, ghiaccio secco e provette per la raccolta del tessuto. Posizionare le provette sul ghiaccio secco dopo aver decapitato un topo utilizzando una ghigliottina per roditori ed aver rimosso l'intero cervello con cervelletto e nervi ottici integri.Posizionare il cervello nella parte superiore di una piastra per colture cellulari priva di RNAsi, di dimensioni 60 per 15 millimetri. Successivamente, trasferirlo sulla superficie di lavoro per il campionamento dei tessuti. Utilizzare una pipetta priva di RNAsi per inumidire in modo conservativo la carta filtrante attaccata al taglia-tessuti con EBSS.Inumidire il tessuto cerebrale con EBSS. Trasferire il cervello nel tritatore di tessuti e posizionarlo con la superficie ventrale appoggiata sulla carta filtro. La linea mediana deve essere perpendicolare alla lama del tritatore e il margine rostrale del cervello deve aderire alla lama.Utilizzare un pennello da artista trattato con A-D-E-P-C per mantenere fermo il cervello applicando una leggera pressione sulla superficie dorsale del cervello mentre lo si tiene immobile. Sollevare la leva del supporto della lama di circa quattro-cinque centimetri al di sopra della superficie del tessuto dorsale e mantenerla in questa posizione. Rimuovere il pennello dalla superficie del cervello e impostare su 750 micrometri.Utilizzo del micrometro. Lasciare che la leva scenda, tagliando il tessuto e creando una sezione coronale di 750 micrometri mentre la lama del tritatore rimane ferma. Utilizzare un movimento rotatorio con il pennello da artista per spostare delicatamente la sezione di tessuto dalla superficie della lama.Posizionare immediatamente la sezione del tessuto nell'EBSS ossigenato all'interno della piastra di Petri. Questa fetta è ora pronta per la microdissezione. Ripetere la procedura di taglio fino a ottenere sezioni seriali del cervello lungo tutto il piano rostro-caudale per eseguire la microdissezione.Prima di tutto, verificare l'illuminazione per assicurarsi che l'illuminazione del campione non venga ostruita. Regolare la posizione e il flusso della miscela O2 CO2 per mantenere un ambiente tamponato e ossigenato per il tessuto. Durante la procedura, identificare la sezione cerebrale coronale che comprende la regione di interesse e, utilizzando un pennello da artista, posizionarla in piano sul fondo della piastra di Petri.Selezionare il campione di tessuto con il diametro appropriato. Tenere ferma la sezione coronale del tessuto con il pennello da artista e posizionare la punta del campionatore di tessuto sulla superficie della sezione. Applicando pressione, spingere la punta del campionatore attraverso la sezione di tessuto fino a farla appoggiare saldamente sul fondo della piastra di Petri.Utilizzare un movimento circolare rotatorio per assicurarsi che la regione di interesse sia stata dissociata dal tessuto circostante. Sollevare con attenzione il campione di tessuto dalla sezione e liberare il micro-punch, permettendogli di galleggiare nell'EBSS utilizzando un pennello da artista. Depositare immediatamente il micro-punch di tessuto in una provetta per conservazione stabile a meno 80 gradi Celsius, mantenuta su ghiaccio secco.Il tessuto dovrebbe aderire facilmente alla parete del tubo. Riporre nuovamente il tubo contenente il campione microdissecato nel ghiaccio secco. Ripetere questa microdissezione per ciascuna regione cerebrale di interesse.Una volta completata la microdissezione, registrare l'etichetta o il codice a barre di ciascun campione contenuto nei tubi. Posizionare i campioni di tessuto in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione dell'RNA per isolare l'RNA dai campioni di tessuto. Innanzitutto, preparare un'area di lavoro priva di RNA.Preparare una quantità sufficiente di miscela di perle magnetiche e soluzione di lisi e legame, come descritto nel manuale del kit per l'isolamento dell'RNA totale. Rimuovere i campioni di tessuto dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio secco. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di lisi e legame a un tubo contenente il campione.Collegare una bacchetta di dimensioni pari a un tubo da 0,5 millilitri priva di nucleasi al mixer per pellet e omogeneizzare il tessuto utilizzando una punta di pipetta priva di nucleasi a bassa ritenzione. Trasferire immediatamente il campione omogeneizzato in una pozzetta di una piastra per colture cellulari rotonda a 96 pozzette, utilizzando lo stesso tipo di punta. Aggiungere 60 microlitri di isopropanolo al 100% al campione.Aggiungere 20 microlitri della miscela di perle al campione e mescolare aspirando e dispensando da tre a quattro volte con una pipetta. Seguire i passaggi del protocollo del kit per l'isolamento di RNA totale per completare l'estrazione di RNA totale. Infine, misurare la purezza e la concentrazione dell'RNA totale ottenuto. I dati provenienti da micro-prelievi di diverse regioni cerebrali sono mostrati in questa tabella.Campioni di RNA diluiti con 30 microlitri di Buffer di eluizione hanno fornito quantità sufficienti di RNA totale per l'utilizzo con prodotti commerciali di preparazione del cDNA destinati a applicazioni di sequenziamento dell'RNA. Inoltre, il rendimento di RNA e i rapporti 260 su 280 sono valori singoli ottenuti da campioni rispettivi di microdissezione, al fine di mostrare le letture ottenute da ciascuna regione cerebrale, confermando l'elevata purezza dei campioni. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in otto-dieci minuti se effettuata correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di minimizzare il rischio di contaminazione da RNA delle superfici di lavoro o dei campioni di tessuto, utilizzando esclusivamente materiali privi di RNA o trattati con DEPC.

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