Non Laser Capture Microscopy approccio per la Microdissezione delle Regioni discreti cervello di topo per la totale isolamento di RNA e valle Next-Generation Sequencing e profili di espressione genica
13 novembre 2011
La profilazione dell'espressione dell'RNA di regioni discrete del cervello di topo richiede una strategia di raccolta dei tessuti precisa e ripetibile. Qui viene descritto un protocollo che utilizza sia il sezionamento coronale del cervello che la microdissezione assistita da carotaggio tissutale. La resa e la qualità dell'RNA totale ottenuto dai campioni risultanti conferma l'utilità del metodo delineato.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di raccogliere l'RNA totale da nuclei cerebrali discreti in modo ripetibile, coerente, economico e privo di RNA. Ciò si ottiene preparando prima un ambiente di lavoro privo di RN e rimuovendo l'intero cervello da un topo decapitato. Successivamente, viene utilizzato un trinciatessuti azionato da micrometro per tagliare sezioni seriali di tessuto di dimensioni uniformi.
Quindi le regioni cerebrali di interesse vengono micro sezionate utilizzando un nucleo di tessuto di diametro prestabilito, mantenendo il tessuto in un ambiente di terreno privo di RNA. Infine, l'RNA totale viene isolato dai nuclei cerebrali asportati. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrino una resa e una qualità sufficienti dell'RNA totale per la preparazione della libreria di CDNA a valle e la profilazione del trascrittoma attraverso saggi fotometrici spettrali o fluorometrici.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'escissione anatomica macroscopica o assistita dalla microscopia a cattura laser, è che più regioni cerebrali discrete di interesse possono essere raccolte da un singolo cervello di topo in modo ripetibile e sufficiente. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, ad esempio se profili di espressione di trascrizione distinti all'interno di regioni cerebrali associate all'assenza di circuiti neuronali possano essere correlati con determinati tratti comportamentali, risposte ambientali e/o stato di malattia. Per prepararsi alla microdissezione, integrare 100 millilitri di soluzione salina bilanciata di Earl o EBSS con 0,44 grammi di bicarbonato di sodio e 0,884 grammi di glucosio.
Trattare l'EBSS con 0,1 millilitri di DEPC in un flacone autoclavabile o in un pallone con tappo a vite per almeno 12 ore. A 37 gradi Celsius. Metti le pipette di vetro da cinque pollici e tre quarti in un bicchiere di vetro da un litro e posiziona i pennelli da artista con le setole rivolte verso l'alto in un cilindro graduato di vetro da 100 millilitri.
Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione acquosa trattata con DEPC per coprire le pipette e gli spazzoloni. Coprire il becher e il cilindro graduato con un foglio di alluminio e incubare per almeno 12 ore a 37 gradi Celsius dopo l'incubazione di 12 ore con DEPC, scaldare tutti i materiali trattati con DEPC a una temperatura superiore a 100 gradi Celsius per almeno 15 minuti. Bello. L'EBSS a temperatura ambiente prima dello stoccaggio a quattro gradi Celsius.
Versare il DD H2O dal becher e dal cilindro graduato e continuare a incubarli a una temperatura superiore a 100 gradi Celsius fino a quando i materiali non sono asciutti. Rimuoverli dall'incubatrice, raffreddarli a temperatura ambiente e conservarli per un uso successivo. Il giorno dell'esperimento, trattare tutte le superfici di lavoro per rimuovere la contaminazione da RNA, posizionare e mantenere l'EBSS in un bagno d'acqua impostato a 40 gradi Celsius per tamponare e ossigenare.
L'EBSS lo infiltra con il 5% di CO2 e il 95% di ossigeno inserendo un tubo del gas in una pipetta da pascolo priva di RNA. E inserendo la pipetta nell'EBSS, coprire l'apertura del contenitore EBSS. Impostare un'affettatrice per tessuti per il sezionamento seriale del tessuto cerebrale.
Trattare le superfici superiore e inferiore dell'affettatrice per tessuti. Per rimuovere la contaminazione da RNA, attaccare un pezzo rettangolare di carta da filtro watman numero quattro alla superficie in plexiglass del tritatessuti. Fissare una lama di rasoio a doppio taglio al braccio del tritatutto.
Impostare il micrometro a zero e regolare l'altezza minima del braccio del tritatutto per consentire alla lametta di tagliare la carta da filtro, ma non la lastra di plexiglass. Raccogli tutti i materiali aggiuntivi necessari per la microdissezione, tra cui piastre per colture cellulari da 60 x 15 millimetri prive di RNA, puntali per micropipette da 200 microlitri senza RNA da 200 microlitri, forbici curve, ghiaccio secco e provette per la raccolta dei tessuti. Metti i tubi sul ghiaccio secco dopo aver decapitato un topo usando una ghigliottina per roditori e aver rimosso l'intero cervello con sia il cervello posteriore che i nervi ottici intatti.
Posizionare il cervello nella parte superiore di un piatto di coltura cellulare privo di RNA di 60 x 15 millimetri. Quindi trasferirlo sulla superficie di lavoro per il campionamento dei tessuti. Utilizzare una pipetta priva di RNA per inumidire in modo conservativo la carta da filtro attaccata al tritatutto con EBSS.
Inumidire il tessuto cerebrale con EBSS. Trasferire il cervello nel tritafazzoletti e posizionarlo con la superficie ventrale appoggiata sulla carta da filtro. La linea mediana perpendicolare alla lama del tritatutto e il bordo rostrale del cervello che si appoggia alla lama.
Usa il pennello da artista trattato A-D-E-P-C per mantenere fermo il cervello applicando una leggera pressione sulla superficie dorsale del cervello mentre tieni fermo il cervello. Sollevare la leva del portalama a circa quattro o cinque centimetri sopra la superficie del tessuto dorsale e tenerla in questa posizione. Rimuovere lo spazzolino dalla superficie del cervello e comporre 750 micrometri.
Utilizzando il micrometro. Lasciare cadere la leva tritando il tessuto e creando una sezione coronale di 750 micrometri mentre la lama del tritatutto rimane ferma. Usa un movimento rotatorio con il pennello da artista per far scorrere delicatamente la sezione di tessuto lontano dalla superficie della lama.
Posizionare immediatamente la sezione di tessuto nell'EBSS ossigenato nella piastra di Petri. Questa fetta è ora pronta per la micro dissezione. Ripetere la procedura di affettatura fino a quando non sono state ottenute sezioni seriali del cervello su tutto il piano codale rost per eseguire la micro dissezione.
Innanzitutto, controlla l'illuminazione per assicurarti che l'illuminazione del campione non sia ostruita. Regolare la posizione e il flusso della miscela di O2 CO2 per mantenere un ambiente ossigenato tamponato per il tessuto. Durante la procedura, identificare la sezione del cervello coronale che include la regione di interesse e, utilizzando un pennello da artista, orientarla sul fondo della capsula di Petri.
Selezionare il nucleo di tessuto con il diametro appropriato. Tenere la sezione di tessuto coronale in posizione con il pennello da artista e portare la punta di taglio del nucleo di tessuto verso il basso sulla superficie della sezione di tessuto. Durante l'applicazione della pressione, premere la punta del nucleo del tessuto attraverso la sezione del tessuto e verso il basso sul fondo della capsula di Petri.
Utilizzare un movimento circolare rotatorio per assicurarsi che la regione di interesse sia stata dissociata dal tessuto circostante. Sollevare con cautela l'anima del tessuto dalla sezione di tessuto e liberare il micro punzone permettendogli di galleggiare nell'EBSS utilizzando un pennello da artista. Depositare immediatamente il micropunzone in tessuto in un tubo di conservazione stabile a meno 80 gradi Celsius conservato su ghiaccio secco.
Il tessuto deve aderire facilmente al lato del tubo. Rimettere il campione micros contenente la provetta nel ghiaccio secco. Ripeti questa microdissezione per ogni regione del cervello di interesse.
Una volta completata la microdissezione, registrare la rispettiva etichetta o i codici a barre per ogni campione contenente la provetta. Posizionare i campioni di tessuto in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino all'estrazione dell'RNA per estrarre l'RNA dai campioni di tessuto. Innanzitutto, prepara uno spazio di lavoro privo di RNA.
Preparare una quantità sufficiente di miscela di biglie magnetiche e soluzione legante la lisi come descritto nel manuale del kit di isolamento dell'RNA totale. Rimuovere i campioni di tessuto dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e posizionare le provette direttamente sul ghiaccio secco. Aggiungere 100 microlitri della soluzione legante la lisi in una provetta di campione.
Collegare un pestello in tubo da 0,5 millilitri privo di nucleasi al miscelatore di pellet e omogeneizzare il tessuto utilizzando un puntale per pipetta privo di nucleasi a bassa ritenzione. Trasferire immediatamente il campione omogeneizzato in un pozzetto su una piastra di coltura tissutale a fondo rotondo a 96 pozzetti, utilizzando lo stesso tipo di punta. Aggiungere 60 microlitri di isopropanolo al 100% al campione.
Aggiungere 20 microlitri della miscela di microsfere al campione e mescolare pipettando su e giù tre o quattro volte. Seguire i passaggi del protocollo del kit di isolamento dell'RNA totale per completare l'estrazione dell'RNA totale. Infine, misurare la purezza e la concentrazione dell'RNA totale risultante I dati provenienti da micro punzoni di varie regioni del cervello sono mostrati in questa tabella.
Icampioni di RNA allusi con 30 microlitri di tampone di evoluzione hanno fornito RNA totale sufficiente per l'uso con i prodotti di preparazione CD NA disponibili in commercio per applicazioni di sequenziamento dell'RNA. Inoltre, la resa dell'RNA e due rapporti 60 a 2 80 sono valori singoli ottenuti dai rispettivi campioni di microdissezione per dimostrare le letture ottenute da ciascuna regione del cervello e confermano l'elevata purezza del campione Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 8-10 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo il rischio di contaminazione da RNA delle superfici di lavoro o dei campioni di tessuto utilizzando solo materiali privi di RNA o trattati con dsy.
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Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo per il profilaggio dell'espressione dell'RNA in regioni discrete del cervello di topo, enfatizzando una strategia precisa e ripetibile di raccolta dei tessuti. Il metodo combina la sezione coronale del cervello con la microdissezione assistita da un estrattore di tessuti per ottenere RNA totale di alta qualità.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Scienza
- Neuroscienza
- Biologia Molecolare
- Profilazione dell'RNA
Sfondo
- Il profilaggio dell'espressione dell'RNA è cruciale per comprendere la funzione del cervello.
- I nuclei cerebrali discreti richiedono una dissezione attenta per un'analisi accurata.
- Mantenere un ambiente privo di RNase è essenziale per l'integrità dell'RNA.
- I metodi precedenti mancavano di coerenza e ripetibilità.
Scopo dello Studio
- Stabilire un protocollo affidabile per l'estrazione dell'RNA dalle regioni cerebrali del topo.
- Garantire un alto rendimento e qualità dell'RNA per applicazioni a valle.
- Facilitare il profilaggio del trascrittoma attraverso metodi migliorati di raccolta dei tessuti.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di un ambiente di lavoro privo di RNase.
- Decapitazione e rimozione dell'intero cervello dal topo.
- Sezionamento uniforme del tessuto cerebrale utilizzando un sezionatore di tessuti a micrometro.
- Microdissezione delle regioni cerebrali bersaglio utilizzando un estrattore di tessuti in un mezzo privo di RNA.
Risultati Principali
- È stato ottenuto un alto rendimento di RNA totale dai nuclei cerebrali dissecati.
- La qualità dell'RNA è stata confermata adatta per la preparazione della libreria di cDNA.
- I risultati supportano l'utilità del metodo per il profilaggio del trascrittoma.
- I test hanno dimostrato una qualità dell'RNA sufficiente per le applicazioni a valle.
Conclusioni
- Il protocollo delineato fornisce un approccio affidabile per l'estrazione dell'RNA.
- Migliora la coerenza e la qualità dei campioni di RNA dalle regioni cerebrali del topo.
- Questo metodo è vantaggioso per future ricerche in neuroscienza che coinvolgono l'analisi dell'RNA.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
This microdissection approach enables reproducible, high-yield total RNA isolation from discrete mouse brain regions, addressing a key bottleneck in neuroscience target validation where low RNA yields from laser capture microscopy hinder transcriptome profiling. By providing consistent RNA quality suitable for next-generation sequencing, the method supports mechanistic de-risking of CNS targets and improves predictive confidence in early discovery workflows. It positions as a scalable, cost-efficient alternative for brain region-specific gene expression studies in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating RNA from specific brain nuclei to correlate transcript expression with neuronal circuit function and behavioral phenotypes.
- Operational Value: Provides repeatable, cost-efficient sample collection from multiple discrete regions per mouse, reducing animal use and increasing throughput for target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers total RNA with sufficient yield and purity for downstream RNA-Seq and qRT-PCR, enabling reliable assay development for gene expression screening in brain tissue models.
- Operational Value: Uses magnetic bead-enabled RNA isolation compatible with high-throughput workflows, supporting standardization across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant transcriptomic profiling in mouse models, aligning with translational biomarker discovery efforts in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders.
- Operational Value: Ensures RNA integrity through RNase-free protocols, improving reproducibility in longitudinal preclinical studies and cross-laboratory data comparability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, where precise brain region RNA profiling informs target selection and prioritization before preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by enabling transcriptomic comparison across discrete brain regions linked to specific neural circuits.
- Screening: Produces standardized RNA inputs suitable for quantitative gene expression screening, enhancing reproducibility in target engagement assays.
- Analytics: Generates high-quality RNA for spectrophotometric and fluorometric quantification, enabling precise input normalization for sequencing and PCR-based applications.
- Translational Research: Connects discovery-phase expression profiling to preclinical continuity by providing disease-relevant transcriptomic data from defined brain regions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue collection and RNA isolation platform applicable across multiple neuroscience projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through precise brain region-specific expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability via RNase-free workflows and minimal hands-on time (8–10 minutes per sample).
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling multiple regional samples from a single animal, reducing costs associated with low-yield methods requiring amplification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by delivering reliable transcriptome data for go/no-go decisions in CNS drug discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy and RNase-free technique to maintain sample integrity during dissection and RNA extraction.
- Depends on access to a micrometer-operated tissue chopper, set-diameter tissue corers, and magnetic bead-based RNA isolation kits.
- Necessitates standardized RNase-free environment protocols across teams to ensure cross-study consistency in RNA quality.
- Adaptation to other brain regions or species may require optimization of tissue core diameter and sectioning parameters.
- Practical limitation: Manual tissue punching may limit ultra-high-throughput applications compared to automated laser capture systems, though it offers superior RNA yield.
